专利名称：：人用细菌多糖-蛋白结合联合疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种人用3价细菌荚膜多糖与蛋白质共价结合物的联合疫苗制剂，含a群、c群流行性脑脊髓膜炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物和b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-蛋白质结合物的联合疫苗。与它相关的技术发明公开在中国专利zl02159032.x中，本发明特别涉及该制剂可用于3月龄以上儿童预防a群、c群流行性脑脊髓膜炎球菌和b型嗜血流感杆菌感染。
背景技术：
：流行性脑脊髓膜炎是一种具有悠久历史的人类传染性疾病，流行地域极广，遍及全球各大洲，至今仍未得到有效的控制。该病的病原体——脑膜炎奈瑟氏球菌只感染人类，人与人之间通过飞沫或分泌物直接传染，通常情况下，这种接触使对方成为一个健康带菌者，根据年龄和环境的不同，10—50。/^的人可成为带菌者。在人体抵抗力下降及特定环境影响下，脑膜炎奈瑟氏菌可以侵入血流，继而发病，通常发生在接触该菌后的--周内。该病来势非常凶猛，伴有严重脑膜感染的综合症状；严重的全身症状主要有败血症、休克、出血、紫癜、弥散性血管内凝血或内脏出血，病死率较高，尽管抗生素有较好的治疗效果，病死率仍维持在5~10%之间。脑膜炎奈瑟氏菌是引起流行性脑脊髓膜炎(以下简称脑膜炎球菌)的病原菌，根据其英膜多糖的特异性可将脑膜炎球菌分成a、b、c、d、29e、h、i、k、l、w135、x、y和z13个血清群，所有血清群的细菌均可致病，但a、b、c、y和ww毒力最强，上述5个血清群占病例数的95%以上，其中a群、c群传染性最强，是引起脑膜炎流行最常见的菌株。a群流行性脑脊髓膜炎球菌荚膜多糖疫苗是第一个用于预防a群流行性脑脊髓膜炎球菌感染的疫苗，应用以后使a群流行性脑脊髓膜炎的发病率及病死率得以大幅度的降低。a群脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗研制成功之后，相继研制出了a群c群脑膜炎球菌3荚膜多糖双价疫苗以及含a、c、y、w135群四价脑膜炎球菌荚膜多糖成分的联合疫苗。由于各国均以a群脑膜炎球菌、c群脑膜炎球菌流行为主，因此，目前各国使用的疫苗主要为a群脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗、或a/c群脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗等。b型嗜血流感杆菌(hib)是引起儿童细菌性脑炎、肺炎、蜂窝组织炎等疾病的主要病原体。在使用有效的疫苗前，美国每年有1.62.5万多名儿童因hib引起感染；其中60。/。的儿章患上最严重的hib感染并发症——细菌性脑炎。其中10。/。因脑炎致死，许多幸存者则造成严重的永久性功能丧失。其他感染包括菌血症、肺炎、脓胸、心包炎、蜂窝纤1织炎、脓毒性关节炎及会咽炎等。19881991年期间，最初获准对大婴幼儿进行hib结合疫苗接种，以后又获准对小婴幼儿进行接种，使b型流感嗜血杆菌侵袭性疾病及相关的发病率及死亡率明显减少。过去几年里，b型流感嗜血杆菌疾病患病人数降低了95%，美国疾病控制及预防中心将5岁以下儿童的b型流感嗜血杆菌疾病作为一种可采用疫苗加以控制的疾病，并计划1996年消除；到1997年7月，该目标己接近实现但尚未完全达到。值得说明的是，在对18个月龄以下儿童广泛使用疫苗前，hib疾病发病率已丌始下降。其可能是山于接种ffib结合疫苗降低了较大儿童的无症状携带率，而导致了18个月龄以下儿童的感染风险降低。这种"群体免疫"作用所达到的效果是使用疫苗前未预料到的，hib结合疫苗的成功免疫，为研究及预防由其他含多糖荚膜的细菌引起的感染提供了可借鉴的经验。作为结合疫苗的载体，必须选择安全有效的蛋白质。这种蛋白质必须对人体没有毒性，也不会引起变态反应，同时又能增强多糖的免疫原性，因此可供选择的种类并不多。目甜使用的载体主要为微生物来源的蛋白质，例如现成的白喉和破伤风类毒素，经基因突变发生减毒的白喉毒素(crm-197)以及细菌的外膜蛋白质等，而且己经用于临床。蛋白质载体也可以源于与多糖同一菌种的致病菌，例如b型嗜血流感杆菌荚膜多糖偶联疫苗可以用该菌的外膜蛋白质作为载体；肺炎球菌荚膜多糖偶联疫苗可以用肺炎球菌的溶血素蛋白质作为载体，其优点是能具有对不同型别的肺炎球菌感染有交叉免疫保护效果。还有一些细菌的毒素蛋白质也可作为载体，例如霍乱毒素、霍乱毒素的b亚单位和大肠杆菌的不耐热肠毒素，因为它们同时还具有佐剂的效应。另外还有绿脓杆菌的外毒素a、p6和一些高分子外膜蛋白质，以及不相关的蛋白质如人血清蛋白等，但是这些蛋白质载体仍处于动物实验阶段，尚未用于临床。至今己经研制成功多种不同的单价细菌荚膜多糖一蛋白结合疫苗及7价肺炎球菌荚膜多糖-crm197白喉类毒素结合疫苗。结合疫苗具有以下一些特点(1)能增强婴幼儿对细菌荚膜多糖的免疫反应，这主要是由于结合疫苗能激活t辅助性淋巴细胞和形成t记忆细胞，重复接种能产生记忆性免疫增强作用，使主要为igg的抗细菌荚膜多糖抗原的抗体水平剧增，对婴幼儿接种后能产生较为持久的免疫保护力。(2)细菌的多糖一蛋白质结合疫苗可成为二价疫苗。这是因为结合疫苗可同时产生针对多糖和蛋白质载体的抗体反应。(3)能增强老年人和某些免疫功能低下或有缺陷的病人对细菌荚膜多糖抗原的免疫反应。例如肺炎是老年人的常见病，肺炎球菌荚膜多糖和蛋白质的结合疫苗可以增强疫苗对老年人的免疫保护力。结合疫苗也可使一些缺乏对细菌荚膜多糖抗原产生免疫反应的个体产生高效价的抗多糖抗原的抗体。(4)结合疫苗具有载体蛋白质的效应。事先或同时接种蛋白质载体会刺激t淋巴细胞的增殖，因而能增强结合疫苗的免疫原性。中国专利zl02159032.x公开了一种多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，主要涉及a、c群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖与多种蛋白质载体的偶联与纯化方法及疫苗的配制方法，该专利所述的多糖-蛋白结合疫苗的价数为3价多糖，利用该专利制备预防用生物制品，经临床研究证明接种30^ig/剂该疫苗可使96.5%以上接种者获得抗a群脑膜炎球菌、c群脑膜炎球菌及91.2%以上接种者获得b型流感嗜血杆菌长期保护性抗体，免受a群脑膜炎球菌、c群脑膜炎球菌及b型流感嗜血杆菌的感染。
发明内容本发明提供了一种含a群、c群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物及b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-蛋白结合物的联合疫苗制剂，本发明的联合疫苗制剂，其中3种结合物混合的比例为i:i:i，每一剂中含有a群、c群脑膜炎球菌荚膜多糖及b型嗜血流感杆菌荚膜多糖的量为530mg。该制剂可用于3月龄以上的儿童，预防a群、c群脑脊髓膜炎和b型嗜血流感杆菌感染。本发明的联合疫苗制剂，其中的蛋白载体为破伤风类毒素。本发明的联合疫苗制剂，其中多糖-蛋白结合物中的多糖与蛋白载体的结合是以多糖用溴化氰活化，然后与己二酰肼的化合物反应，在碳二亚胺的作用下与蛋白载体共价结合，属于现有技术。本发明的联合疫苗制剂，其特征在于，还可含有氢氧化铝或磷酸铝作为佐剂，加入量为0.20.8mg铝佐剂/剂量。本发明的联合疫苗制剂是注射剂，肌肉注射。本发明的联合疫苗制剂的制备方法，包括将a群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白结合物，c群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白结合物和b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-蛋白结合物混合的步骤，制剂的制备可使用制剂学常规技术。本发明的疫苗可用于免疫3月龄以上各年龄段的儿童，预防儿童罹患a、c、流行性脑脊髓膜炎球菌、b型嗜血流感杆菌引起的感染性疾病。它的特点是既能增强多糖抗原的免疫原性，又能减少婴幼儿接种疫苗的次数，减轻婴幼儿的痛苦和家长的精神负担。降低免疫接种成本，提高免疫覆盖率，同时三者联合具有协同作用。本发明的联合疫苗可以和目前市售的多种含铝佐剂疫苗如氢氧化铝/磷酸铝吸附白喉-百fl咳-破伤风疫苗、基因重组乙型肝炎疫苗、破伤风类毒素疫苗等混合使用。具体实施例方式以下通过实施例进一歩说明本发明。实施例一a、c群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖结合疫苗的制备按中国专利zl02159032.x中实例一、二、三中所述的方法分别制备a群脑膜炎球菌荚膜多糖-tt结合疫苗原液、c群脑膜炎球菌荚膜多糖-tt结合疫苗原液、b型嗜血流感杆菌英膜多糖-tt结合疫苗原液。将a群脑膜炎球菌荚膜多糖-tt结合疫苗原液、c群脑膜炎球菌荚膜多糖-tt结合疫苗原液、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-tt结合疫苗原液分别稀释至60~12(vg/ml(按多糖计算)，将以上3种稀释后的疫苗液按所需量加入到-一无菌容器内，充分混合后，加入一定量的无菌无热原的氯化钠、氢氧化铝佐剂和注射用水，充分混匀后48'c放置。按0.6ml/瓶的量分装，即为每剂含a群、c群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各10ng的氢氧化铝吸附ac群脑膜炎球菌一b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗。喜贝康tm(hibacon)是本公司ac群脑膜炎球菌一b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的商品名。实施例二hibacon在l一2岁儿童中的临床研究试验按上述实施例一方法在gmp车间按gmp要求制备的3批ac群脑膜炎球菌一b型嗜血流感杆菌荚膜多糖结合疫苗，每毫升疫苗含a群、c群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各20pg。国家食品药品监督管理局抽检一批为临床试验用疫苗。临床研究的采用双盲法进行，符合入组年龄段的接种人群均为从未接种a群或a c群脑膜炎球菌多糖疫苗和b型嗜血流感杆菌结合疫苗。临床研究分4个研究组(分别为2个不同免疫程序组，每个程序组分别接种不同剂6量(15吗、30pg)试验疫苗，tl、t3为半量(15吗/0.25ml)接种组，t2、t4为全量(30(ig/0.5ml)接种组。tl、t2和t3、t4分别为1—2岁组1剂组和2剂组。cl、c2为1剂组对照疫苗。cl为hib的阳性对照(b型流感嗜血杆菌结合疫苗，10叫/0.5ml，兰州生物制品研究所生产，)，c2为阴性对照(重组乙型肝炎疫苗5pg/剂，北京天坛生物制品股份有限公司生产，简称乙肝疫苗)。试验分组见表l。表1试验分组与观察人数tableseeoriginaldocumentpage7
在1一2岁儿童组分别接种1针次、2针次，每针次间隔28—32天，对照组b型嗜血流感杆菌结合疫苗和重组乙型肝炎疫苗(酵母)。研究疫苗的免疫剂量分别为15pg/0.25ml/剂和30昭/0.5ml/剂2个剂量组。临床研究共接种研究疫苗240人(355针次)，对照疫苗119人(119针次)。接种研究疫苗男性135人(平均月龄17.36)，女性105人(平均月龄17.45)。收集接种后安全性试验针次例数分别为353针次和117针次。统计不良反应数据，局部和全身不良总反应率和中度以上反应率统计结果见表2。分别于免疫接种前和完成全程免疫后28—35天采集血液，分离血清，测定抗体滴度甜将血清放置于-2(tc。采用世界卫生组织认可的血清杀菌试验(sba)测定a群、c群脑膜炎球菌抗体滴度和采用酶联免疫法测定b型嗜血流感杆菌抗体含量方法(世界卫生组织技术报告丛书，no.897，2000附录l)，测定疫苗的免疫原性。l一2岁儿童接种不同免疫程序和免疫剂量后血清中抗a、c群脑膜炎球菌和hib抗体阳转率和各实验组比较结果见表3、表4。hib抗体阳转率分别用产生保护性抗体达到0.15pg/ml和达到长期保护性抗体1.0pg/ml2个标准进行统计。表3的结果显示，1-2岁的儿童用15吗剂量的hibacon免疫2次或30)ig剂量的hi.bacon免疫1次后，95%以上的儿童可以产生能抵御a群脑膜炎球菌、c群脑膜炎球菌、以及b型流感嗜血杆菌感染的高水平抗体。
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*免疫前hib抗体》0.076ng/ml的受试者，其免疫后h化抗体增长4倍或4倍以上者计为阳转例数。
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实施例三hibacon在3—8月龄婴儿中的临床研究试验按上述实施例一方法制备的3批ac群脑膜炎球菌一b型嗜血流感杆菌荚膜多糖结合疫苗，每剂hibacon疫苗含a群、c群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各io叱。临床研究的采用双盲法进行。符合入组年龄段的接种人群均为从未接种a群或a十c群脑膜炎球菌多糖疫苗和b型嗜血流感杆菌结合疫苗。临床研究分2个研究组，每个组分别接种不同剂量(15pg、3(vg)研究疫苗，对照组为b型流感嗜血杆菌结合疫苗d3—8月龄婴幼儿组接种3针次，每针次间隔28—32天。临床研究共接种研究疫苗118人(347针次)，对照疫苗60人(175针次)，接种研究疫苗男性54人(平均月龄5.41)，女性64人(平均月龄5.41)。收集接种后安全性试验针次例数分别为347针次和173针次。收集接种后不良反应数据，局部和全身不良总反应率和中度以上反应率统计结果见表5。hibacon疫苗各剂量组间局部反应、全身反应的发生率无显著显差异，与对照疫苗hib相比，局部反应、全身反应的发生率亦无显著性差异。分别于免疫接种前和完成全程免疫后28—35天采集血液，分离血清，测定抗体滴度前将血清放置于-2(tc。采用世界卫生组织推荐的血清杀菌试验测定a群、c群脑膜炎球菌抗体滴度和采用酶联免疫法测定b型嗜血流感杆菌抗体含量方法检定临床研究该疫苗的免疫原性。3—8月龄婴幼儿接种不同免疫剂量后血清中抗a、c群脑膜炎球菌和hib抗体阳转率及各组比较结果见表6、表7。表5试验组和对照组总反应率、中度以上反应率统计结果疫苗组別针次观察针次局部总反应全身总反应反应数(％)中度以上(%)x2反应数(％)中度以上(%)hibacon15吗/齐u31676(3.59)2(1.20)1.00025(14.97)16(9.58)4.5210.034hibacon30吗/剂318010(5.56)2(1.11)12(6.67)9(5.00)hibacon15吗/剂31676(3.59)2(1.20)/0.24125(14.97)16(9.58)0.4650.495hib31731(0.58)0(0)22(12.72)13(7.51)hibacon30)jg7剂318010(5.56)2(1.11)/0.柳12(6.67)9(5.00)0.9540.329hib31731(0.58)0(0)22(12.72)13(7.51)11
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表6的结果显示，3-8月龄的儿童接种30ng剂量的hibacon疫苗3次后，90%以上的儿童其血液中存在的抗a群脑膜炎球菌、c群脑膜炎球菌、b型流感嗜血杆菌抗体的水平足以抵御相应细菌的感染。3-8月龄的儿童接种15吗剂量的hibacon疫苗3次后，只有75。/。以上的儿章其血液中存在的抗a群脑膜炎球菌、c群脑膜炎球菌、b型流感嗜血杆菌抗体的水平足以抵御相应细菌的感染。表7的结果显示，30|ig剂量的hibacon疫苗免疫38月龄儿童的效果明显优于15吗剂量的hibacon疫苗。权利要求1、一种人用细菌多糖-蛋白质结合物联合疫苗制剂，其特征在于，含有a群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白结合物，c群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白结合物和b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-蛋白结合物，3种结合物的重量比例为1∶1∶1。2、权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，按多糖计算每剂含a群、c群流行性脑脊髓膜炎球菌荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖各5-30)lig。3、权利要求2的联合疫苗制剂，其特征在于，每剂含a群、c群流行性脑脊髓膜炎球菌荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖各lo)ig。4、权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，还含有氢氧化铝或磷酸铝作为铝佐剂，加入量为0.20.8呢铝佐剂/剂。5、权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，是液体剂型或冷冻干燥制成冻干粉剂型。6、权利要求l的联合疫苗制剂，其特征在于，是注射剂。7、权利要求6的联合疫苗制剂，其特征在于，所述注射剂用于皮下或肌肉注射。8、权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，可以和目前市售的多种含铝佐剂疫苗如氢氧化铝/磷酸铝吸附白喉-百日咳-破伤风疫苗、基因重组乙型肝炎疫苗、破伤风类毒素疫苗等混合使用。9、权利要求1的联合疫苗制剂在制备用于预防a群、c群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血杆菌引起的感染的疫苗制剂中的应用。10、权利要求1的联合疫苗制剂的制备方法，其特征在于，包括将a群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白结合物，c群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白结合物和b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-蛋白结合物混合的步骤。全文摘要本发明将a群、c群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖通过化学的方法以共价键结合到有效的蛋白载体上，制备人用预防性的联合多糖-蛋白结合疫苗，3-8月龄的儿童接种3针，间隔1个月，1岁以上儿童接种1针，免疫接种后1个月可使96.5％以上免疫接种者获得a群、c群群脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌免疫，可使91.2％以上免疫接种者获得b型流感嗜血杆菌长期免疫力，用于预防a群、c群群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血杆菌引起的感染。文档编号a61p31/04gk101559222sq200910143818公开日2009年10月21日申请日期2009年5月31日优先权日2009年5月31日发明者健孔,蒋仁生,蒋先敏申请人:北京绿竹生物制药有限公司;北京绿竹生物技术有限责任公司