专利名称：：用于缀合疫苗的经过修饰的多糖的制作方法用于缀合疫苗的经过修饰的多糖1.发明领域本发明涉及制备免疫原性糖缀合物(特别是用于在受试者中诱导治疗性免疫应答的药物组合物中使用的免疫原性糖缀合物)的方法。本发明的免疫原性糖缀合物包含一种或多种低聚糖或多糖，该低聚糖或多糖通过活性醛基缀合于一种或多种载体蛋白质。因此，本发明提供了制备以下物质的方法(i)不饱和的微生物的n-酰基衍生物低聚糖或多糖；(ii)不饱和的n-酰基衍生物的新颖的缀合物；以及(iii)糖缀合物组合物，其包含用作一种或多种蛋白质的共价连接体的微生物的不饱和n-酰基衍生物的片段的缀合物分子。本发明另外包括所述免疫原性糖缀合物药物组合物用于预防或治疗感染性疾病的用途。2.
背景技术：
：在全世界，由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的微生物感染引起严重的发病率，所述革兰氏阳性菌例如链球菌(str印tococcus)、葡萄球菌(st即hylococcus)、肠球菌(enterococcus)、芽孢杆菌(bacillus)、棒状杆菌(corynebacterium)、李其jf特菌(listeria)、丹毒丝菌(erysipelothrix)和梭状芽孢杆菌(clostridium)，所述革兰氏阴性菌例如嗜血杆菌(haemophilus)、志贺氏菌(shigella)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、奈瑟氏球菌(neisseria)和某些类型的大肠杆菌(escherichiacoli)。例如，链球菌是革兰氏阳性菌的一个大的和变化的属，该属基于链球菌的细胞壁多糖的抗原性和结构而被分成几群(lancefield，r.c.1933，aserologicaldifferentiationofhumanandothergroupsofhemolyticstreptococci.j.exp.med.57:571—595;lancefield，r.c.1938，amicro—precipitintechniqueforclassifyinghemolyticstreptococciandimprovedmethodsforproducingantigen.proc.soc.exp.biol,andmed.38:473-478;其各自被全文并入本文作为参考)。例如，b群链球菌基于荚膜多糖被分类为若干不同的类型，例如ia、ib、ii、iii、iv、v、vi、vi1和viii型，它们负责产生大部分的致病性。与使用许多其它人细菌性病原体的发现相似，在用于疫苗时，b群链球菌的荚膜多糖可以提供有效的针对这些细菌感染的保护(参见，wessels等人，1990.imm皿ogenicityinanimalsof即olysaccharide-proteinconjugatevaccineagainsttypeiiigroupbstr印tococcus.j\clin.invest.86:1428-1433;wessels等人1993，stimulationofprotectiveantibodiesagainsttypelaandlbgroupbstr印tococcibyatypelapolysaccharide—teta皿stoxoidconj卿tevaccine.infect.i匪n.61:4760-4766;其各自被全文并入本文作为参考)。革兰氏阴性菌也是发病率和死亡率的重要原因。在针对b型流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)细菌(hib)的多糖_蛋白质疫苗的新近开发和使用之前，hib细菌感染导致婴儿精神发育迟缓的许多病例。婴儿和幼年儿童典型地具有差的对多糖抗原的免疫原性应答。这些应答的特征是不依赖t细胞，并且因此不涉及例如记忆、同种型转换或亲和力成熟的重要属性，所述重要属性是赋予针对随后感染的长期免疫学防护所必需的。为了解决在婴儿和幼年儿童对多糖的有效免疫原性应答的缺乏，本领域中已经努力开发用于通过将多糖细菌抗原共价偶联于载体蛋白以形成缀合物分子而将不依赖t细胞的应答转换为t细胞依赖性应答的方法。参见，je皿ings等人美国专利第4，356，170号，其全文并入本文作为参考。佐剂是加强对抗原的免疫应答的物质，因此已经在许多疫苗和疫苗候选物中有所应用。佐剂的免疫剌激作用不是抗原特异性的，因为它们加强针对许多不同类型抗原的免疫应答。目前被fda批准人用的唯一的佐剂是铝盐，但是用于动物接种和在较新的疫苗候选物中使用的许多佐剂在来源上是微生物的(white,r.g.，1976，theadjuvanteffectofmicrobialproductsontheimmuneresponse.ann.rev.microbiol.30:579-595，被全文并入本文作为参考)。这种佐剂包括弗氏佐剂、小棒状杆菌、胞壁酰二肽、破伤风类毒素等。多糖对载体蛋白的缀合可以有效地使多糖更具免疫原性。本领域中已知的载体蛋白质包括破伤风毒素/类毒素、crm^、得自革兰氏阴性菌的外膜蛋白质(例如，高分子量蛋白质)、得自不可分类的流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)的p6和p4、得自粘膜炎莫拉氏菌(moraxellacatarrhalis)的cd和uspa、白喉毒素/类毒素、去毒的绿脓假单胞菌毒素(pseudomonasaeruginosatoxin)a、霍舌l菌毒素/类毒素、百曰咳毒素/类毒素、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)外毒素/类毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、轮状病毒vp7蛋白质或呼吸道合胞病毒f和g蛋白质。由于作为载体的这种能力，破伤风类毒素已经使用了数十年，并且已经确定了其安全性特征。针对多种细菌感染的荚膜多糖(cp)缀合物疫苗目前处于开发和临床评价阶段。在单独的注射剂中包含被组合的多种cp血清型目前正在研究之中。然而，将cp缀合物疫苗组合在单独的多价注射剂中可以导致不同组分之间的竞争并且不利地影响任何单独缀合物的免疫原性(fattom等人，1999，vaccine17:126-33，被全文并入本文作为参考)。本领域中已经描述了多种用于将荚膜多糖缀合于蛋白质的方法。多糖对载体蛋白的缀合可以有效地使多糖更具免疫原性(robbins，j.b.和r.schneerson.1990，polysaccharide—proteinconjugates:anewgenerationofvaccines.j.infect.dis.161:821-832;被全文并入本文作为参考)。另一个综述参见contributionstomicrobiologyandlmm皿ology，vol10，conjugatevaccines,volumeeditionsj.m.cruse和r.e.lewis,jr.，1989(被全文并入本文作为参考)。在一个方法中，多糖经过弱酸水解，产生能够与蛋白反应以形成共价键的还原性端基(anderson,p.a.，1983，infect.immun.，39:233-238;被全文并入本文作为参考)。然而，参与缀合于蛋白质的末端糖基团在半縮醛和醛之间存在有平衡，因此对蛋白质的偶联效率低。为了克服末端还原糖的差反应性，本领域中转向轻度氧化以便在用于缀合于蛋白质的多糖的末端位置引入稳定的醛基(参见，jennings等人，美国专利第4，356，170号，同上)。其它可用的方法，例如一些多糖的通过104—氧化进行活化，仅能产生每个多糖分子的一个活性部位并且随后对载体蛋白的偶联产生单一末端的糖缀合物疫苗。这种方案出现在例如用于c型、b型脑膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitidis)的糖缀合物疫苗和用于链球菌a群的糖缀合物疫苗中。然而，每分子的单一活性部位限制了免疫原性增强的程度。63.
发明内容本发明提供具有多个活性部位的多糖，其允许通过缀合于适当的载体蛋白而生成免疫原性交联的糖缀合物疫苗。此外，所述方法还适用于任何包含氨基糖的多糖，这是优于现有的i04—氧化方法的明显的优点，所述i04—氧化方法需要在糖链中具有两个相邻的(即邻位的)游离羟基(-0h)基团。本发明涉及制备免疫原性糖缀合物(特别是用于在受试者中诱导治疗性免疫应答的药物组合物中使用的免疫原性糖缀合物)的方法。本发明的免疫原性糖缀合物包含一种或多种低聚糖或多糖，该低聚糖或多糖通过活性醛基缀合于一种或多种载体蛋白质。与本领域中已知的先前的缀合方法不同，本发明提供适用于任何包含至少一个氨基糖的多糖的方法，该方法还产生保持抗原性的充分界定的可溶性缀合物。本发明提供制备免疫原性糖缀合物的方法，其包括以下步骤使包含一个或多个氨基糖的低聚糖或多糖中的至少一个n-乙酰基脱乙酰化，形成具有至少一个，优选多个氨基糖的低聚糖或多糖，所述氨基糖包含伯氨基；用包括至少4个碳长度的不饱和烃基部分的n-酰基部分取代所述伯氨基中的至少一个，从而产生在一个或多个烃基部分的不饱和位置处包括至少一个，优选多个活性部位的低聚糖或多糖；使所述化合物与氧化剂接触，在低聚糖或多糖的一个或多个不饱和位置上产生活性醛(-ch0)基团；以及使所述化合物与载体蛋白缀合，从而产生免疫原性糖缀合物。在可供选择的实施方案中，本发明提供制备免疫原性糖缀合物的方法，其包括以下步骤用包括至少4个碳长度的不饱和烃基部分的n-酰基部分取代低聚糖或多糖中的至少一个n-乙酰基，从而产生在一个或多个烃基部分的不饱和位置处包括至少一个，优选多个活性部位的低聚糖或多糖；使所述化合物与氧化剂接触，在低聚糖或多糖上的烃基部分的一个或多个不饱和位置产生活性醛(-ch0)基团；以及使所述化合物与载体蛋白缀合，从而产生免疫原性糖缀合物。根据本发明的方法，所述n-酰基部分包括不饱和的烃基部分。在某些实施方案中，所述不饱和的烃基部分是c3、q、c5、ce、c7、c7、c8、c9、q。或cn部分，并且可以在碳主链内包括一个或多个双键。在某些实施方案中，所述不饱和的烃基部分仅包括一个双键，即，一个不饱和位置。在其它实施方案中，n-酰基部分是n-戊烯酰基部分。所述不饱和的n-酰基部分可以包含本文中所述的或本领域中已知的适合于在不饱和位置氧化为活性醛并且随后与载体蛋白缀合的任何不饱和的烃基部分，例如，不饱和的酰基酸酐(例如，戊烯酸酐)或不饱和的酰基卤(例如，戊烯酰氯、丙烯酰氯)。本发明的分子的氧化优选局限于不饱和n-酰基部分的双键(即，不饱和烃基部分的不饱和位置)的氧化，因此在本文中定义的或本领域中已知的温和条件下进行，例如，如本领域中已知的，在ph4-9.5的范围内使用高碘酸盐进行氧化。由于温和的氧化条件，位置太接近酰基的不饱和位置不能被氧化和/或不能形成活性醛基以允许随后与载体蛋白缀合。因此，为了用于本发明的方法，不饱和的烃基的不饱和位置(即，双键的位置)既不在不饱和烃基的碳1和碳2之间，也不在碳2和3之间(关于本领域中接受的和本申请中使用的烃基的编号，参见例如，图1)。在某些实施方案中，所述不饱和的烃基部分仅包括一个双键。在其它实施方案中，不饱和的烃基部分包括在主链碳链的末端两个碳之间的双键。本发明另外提供免疫原性糖缀合物，其包含a)包含一个或多个氨基糖的至少一7个低聚糖或多糖，以及b)与所述低聚糖或多糖缀合的载体蛋白；所述低聚糖或多糖制备如下i)将所述一个或多个氨基糖的n-乙酰基脱乙酰化；ii)将所得到的氨基糖的伯氨基用包括至少4个碳的不饱和烃基的n-酰基取代；以及iii)将所述不饱和烃基氧化，以生成在主链的末端具有活性醛基的至少3个碳的烃基；根据本发明的方法，不饱和烃基的不饱和(即，双键)的位置既不在主链的碳1和碳2之间，也不在主链的碳2和碳3之间(关于碳的编号，参见例如，图1)。在优选实施方案中，所述不饱和的烃基链具有至少5个碳的长度。在其它实施方案中，在氧化之前，烃基链的不饱和位置在不饱和烃基链的末端两个碳之间。根据本发明的方法，载体蛋白通过本领域中已知的和/或本文中所述的任何方法经由活性醛基缀合于至少一个多糖或低聚糖。本发明还提供免疫原性糖缀合物，其包含a)包含一个或多个氨基糖的至少一个低聚糖或多糖，所述氨基糖包括一个或多个n-乙酰基，其中所述一个或多个n-乙酰基已经被包括至少3个碳的烃基并在所述烃基主链的末端包括活性醛基的n-酰基取代；以及b)与所述低聚糖或多糖缀合的载体蛋白。在优选实施方案中，包括活性醛基的烃基链具有至少4个碳的长度。根据本发明的方法，载体蛋白通过本领域中已知的任何方法(例如，还原胺化)和/或本文中所述的任何方法，经由活性醛基，缀合于至少一个多糖或低聚糖。根据本发明，多糖或低聚糖的一个或多个氨基糖上的至少一个n-乙酰基被取代，以形成如下(式i)的化合物suga产nh其中&是不饱和的c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c1q或cn烃基部分，其中fsugarj表示多糖或低聚糖的所述一个或多个氨基糖。在某些实施方案中，所述一个或多个氨基糖是多糖或低聚糖的重复单位的组分。在其它实施方案中，所述一个或多个氨基糖不是多糖或低聚糖的重复单位的组分。在特定的实施方案中，&是例如c3或c4，使得分别形成n-丁烯酰基或n-戊烯酰基。在其它实施方案中，rd又包含一个双键，即，不饱和位置，所述双键处于烃基主链的末端2个碳之间。所述不饱和的n-酰基部分用作通过将不饱和位置氧化为活性醛基并且随后缀合于所述蛋白质，使低聚糖或多糖与载体蛋白缀合的连接部分。烃基部分的不饱和位置的氧化可以通过本文中所述的和/或本领域中已知的任何方法进行，例如使用高碘酸盐。因为氧化可以裂解多糖链，所以本发明包括的氧化步骤仅在温和条件下进行，例如，在约4约9.5的ph范围，在低温(例如，约fc约27°c)进行。由于温和的氧化条件，为了使不饱和位置被有效地氧化，不饱和烃基部分的双键不能处于不饱和烃基主链的碳1和碳2之间或碳2和碳3之间(关于碳的编号，参见例如，图1)。在根据这个实施方案的非限制性实例中，其中&是不饱和的c3部分(形成式1中的n-丁烯酰基)，所述n-酰基包括处于烃基主链的碳3和碳4之间的双键。在其它实施方案中，其中&包括多于3个碳的链，不饱和位置可以处于大于碳4的位置。根据本发明的产品和方法，在氧化和缀合之后，糖缀合物的蛋白质和低聚糖或多糖通过如下所示的连接共价连接(式ii中的框内部分)其中r2是饱和c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9或c1q烃基部分，并且其中nh(框内)属于蛋白质的伯nh2基团之一，例如，赖氨酰基或精氨酰基残基。式n的fsugar)表示多糖或低聚糖的所述一个或多个氨基糖。在某些实施方案中，所述一个或多个氨基糖是多糖或低聚糖的重复单位的组分。在其它实施方案中，所述一个或多个氨基糖不是多糖或低聚糖的重复单位的组分。式n的&衍生自式i的iv选择式i的rjs卩，不饱和的烃基部分)，使得在氧化和缀合之后，如本领域中已知的和/或本文中描述的，得到期望的连接部分r2或式ii(即，饱和的烃基部分)。根据本发明的方法，多糖或低聚糖的一个或多个氨基糖的n-乙酰基可以在任何位置连接于氨基糖，包括糖的1、2、3、4或5位。氨基糖的结构为本领域中公知的，因此，所述连接的位置可以按照惯例确定。例如，在氨基糖是glcnac时，糖的n-乙酰基处于碳2位；在氨基糖是唾液酸时，糖的n-乙酰基处于碳4位。在特定的实施方案中，糖分子的n-乙酰基被n-戊烯酰基取代，其中n-戊烯酰基用作使低聚糖或多糖与载体蛋白缀合(例如通过还原胺化来缀合)的连接部分。在特定的实施方案中，在氧化和缀合之后，所述连接基团是具有饱和的c4主链的饱和n-酰基。根据本发明的方法，被取代的n-乙酰基可以是任何氨基糖(包括但不限于glcnac、mannac、galnac和唾液酸)的n-乙酰基。在本发明的某些实施方案中，使用碱进行n-乙酰基的取代作用。本发明包括使用适合于在免疫原性缀合物疫苗中使用并且功能在于将不依赖t细胞的免疫应答转化为t细胞依赖性免疫应答的本领域中已知的和/或本文中描述的任何载体蛋白。在某些实施方案中，载体蛋白是细菌蛋白或其片段，例如，细菌毒素或类毒素或其片段。可以根据本发明的方法使用的载体蛋白的非限制性实例包括破伤风毒素或类毒素、crm^、得自革兰氏阴性菌的外膜蛋白质、得自不可分类的流感嗜血杆菌的p6和p4、产生自b型流感嗜血杆菌的蛋白质、得自粘莫炎莫拉氏菌的cd和uspa、白喉毒素/类毒素、去毒的绿脓假单胞菌毒素a、霍乱菌毒素/类毒素、百日咳毒素/类毒素、产气荚膜梭菌外毒素/类毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、轮状病毒vp7蛋白质和呼吸道合胞病毒f蛋白质和g蛋白质。蛋白质在某些实施方案中，根据本发明的方法使用的低聚糖或多糖是得自细菌的多糖或其抗原性片段。该细菌包括但不限于链球菌、葡萄球菌、肠球菌、芽孢杆菌、棒状杆菌、李斯特菌、丹毒丝菌、梭状芽孢杆菌、志贺氏菌、克雷伯氏菌、霍乱弧菌、奈瑟氏球菌和埃希氏菌。在相关的实施方案中，低聚糖或多糖是产生自任何有荚膜的细菌的荚膜多糖，例如ia型、ib型、11型、111型、v型、vi型或viii型b群链球菌；a群链球菌；b型、c型、y型或w135型脑膜炎奈瑟球菌；iii型、iv型或xiv型肺炎链球菌；或大肠杆菌kl。在优选实施方案中，选择低聚糖或多糖，使得能够诱导针对衍生得到该低聚糖或多糖的细菌的免疫应答。在某些实施方案中，低聚糖或多糖不是天然存在的低聚糖或多糖，例如，可以是通过本领域中已知的任何技术合成的，或者是可以产生自天然存在的化合物但是经过修饰的，使得得到的低聚糖或多糖在自然界中没有被发现。例如，多糖或低聚糖可以经过修饰，以增加针对野生型多糖或低聚糖对应物的抗原性，例如，诱导得到增强的免疫应答。根据本发明的方法，有用的多糖包括至少一个能够诱导免疫特异性应答的抗原性抗原表位。这种多糖或低聚糖优选包含至少7个糖部分，但是可以在仅有两个糖部分的情况下表现出活性。多糖或低聚糖可以是无支链的或有支链的，并且可以具有约iooo到几百万道尔顿的分子量。在某些实施方案中，所述多糖或低聚糖具有一个或多个化学修饰。本发明所包括的化学修饰的非限制性实例包括多糖的羧化、磺化、硫酸酯化和磷酸酯化衍生物、它们的盐、及其混合物。本发明还包括组合物(特别是药物组合物)的用途，所述组合物包括用于在受试者中诱导免疫应答的治疗有效浓度的一种或多种免疫糖缀合物。诱导对所述免疫糖缀合物的低聚糖或多糖的免疫应答可用于治疗和/或预防致病生物引起的感染，所述低聚糖或多糖产生自该致病生物。因此，在某些实施方案中，本发明的糖缀合物可用作用于预防的疫苗或作为治疗剂。在某些实施方案中，免疫糖缀合物包含产生自多个类型或菌株的细菌的多种多糖和/或低聚糖，从而诱导针对所述多个物种/类型或菌株的细菌免疫应答。在其它实施方案中，合成用于生产本发明的免疫糖缀合物的低聚糖或多糖，以包括得自多个物种/菌株的细菌和/或其它致病生物(例如，原生动物)的多种抗原性结构域，使得在将其对受试者给予时产生多价免疫应答。本发明还涉及用于人或动物的免疫原性制剂，尤其涉及包含一种或多种本发明的免疫糖缀合物的免疫原性组合物。在某些实施方案中，所述免疫原性制剂包括多种免疫糖缀合物和/或多种载体蛋白质。因为可以设计所述免疫糖缀合物，以包括得自多个类型或菌株的细菌的多糖或低聚糖和/或设计其以包括嵌合的多糖或低聚糖(即，包括得自多个类型和/或菌株的细菌的表位的多糖或低聚糖)，所以可以设计本发明的免疫原性制剂，用于针对多个细菌类型、一种菌株变体和或多种菌株变体的预防或治疗。可以使用本领域中公知的和常规的许多方法，以使用本发明的免疫原性制剂使受试者免疫，所述方法包括但不限于鼻内、气管内(intratrachial)、经口、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下的途径。3.1术语如本申请中使用的，在与数字一起使用时，术语"约"或"大约"是指在所引述的数字的1%、5%或10%范围内或在用于测量和/或确定所述数字的标准方法的典型实验误差范围内的任何数字。术语"载体"、"载体蛋白"或"载体多肽"可互换地使用，是指共价连接有多糖抗原10的多肽部分。载体蛋白经常是免疫原性的，因此也可以有助于疫苗的效价。与载体蛋白的连接典型地增加缀合的碳水化合物分子的抗原性。所述载体蛋白可以与连接于其上的多糖得自相同的目标生物体，或者可以得自不同的生物体。例如，载体蛋白可以是细菌蛋白，包括但不限于细菌毒素或类毒素。在优选实施方案中，选择载体蛋白，使得其起到将不依赖t细胞的免疫应答转化为t细胞依赖性免疫应答的作用。如本申请中使用的，在对受试者给予一种或多种治疗的情况中使用的术语"联合"是指使用超过一种的治疗(例如，不止一种的预防剂和/或治疗剂)。使用术语"联合"没有限制对受试者给予治疗(例如，预防剂和/或治疗剂)的顺序。第一治疗(例如，第一预防剂或治疗剂)可以在对受试者给予第二治疗(例如，第二预防剂或治疗剂)之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时之前)、与其同时或在其之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时)给予。在特定的实施方案中，本发明的免疫原性糖缀合物可用于与本领域中已知用于预防或治疗感染性疾病(例如，由感染一个或多个物种/菌株的细菌所引起的疾病)的一种或多种另外的治疗(例如，疫苗)联合。如本申请中使用的，术语"控制"、"应对"和"管理"是指受试者从治疗(例如，预防剂或治疗剂)得到的有利作用，所述治疗没有引起疾病的治愈。在某些实施方案中，对受试者给予一种或多种治疗(例如，预防剂或治疗剂，例如本发明的组合物)来控制感染性疾病或与其相关的病况或症状，以便防止疾病/障碍的进展或恶化。如本申请中使用的，术语"预防"、"阻止"和"防止"是指由于给予了治疗(例如，预防用组合物或治疗用组合物)而预防了受试者的疾病/障碍(例如，细菌感染)的发病、复发或减少其一种或多种症状。如本申请中使用的，"预防"还包括预防被与用作疫苗的本发明的免疫用缀合物有关的一个或多个细菌类型和/或菌株的感染。本申请中使用的"多糖"和"低聚糖"以其最广泛的意义使用，是指包括多个重复单位的糖，包括但不限于具有2到2，000个以上重复单位的糖。典型地，如本领域中所接受的和本申请中使用的，术语"多糖"是指具有约50到约2，000或更多个重复单位的糖。如本领域中所接受的和本申请中使用的，术语"低聚糖"是指具有约5到约40、45或50个重复单位的糖。多糖的重复单位可以是单一的单糖分子，或者可以是二糖分子。在某些实施方案中，所述重复单位是3个或更多个单糖分子。根据本发明的方法，可以将得自不同类型和/或菌株的细菌的多糖或低聚糖片段化学结合或合成接合，以形成单独的多糖或低聚糖链，所述多糖或低聚糖链包括最初得到所述片段的多个类型和/或菌株的细菌的多种抗原表位，所述片段衍生自所述细菌和/或从所述细菌中鉴定；因此，在整个糖链上，本发明的多糖或低聚糖的重复单位的组成不必须是不变的。本发明的方法所包括的多糖或低聚糖包含一个或多个氨基糖。在某些实施方案中，所述一个或多个氨基糖是多糖或低聚糖的重复单位的组分。在其它实施方案中，所述一个或多个氨基糖不是多糖或低聚糖的重复单位的组分。如本申请中使用的，术语"受试者"或"患者"可互换地使用。如本申请中使用的，术语"受试者"和"多个受试者"是指动物(例如，哺乳动物)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，骆驼、驴、斑马、牛、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩和人)。在一些实施方案中，受试者是非人类的哺乳动物。在其它实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，受试者是人类的婴儿、幼儿、青少年、女性或妊娠的女性。本申请中使用的术语"治疗性免疫应答"是指通过标准技术测量的体液免疫和/或细胞免疫的增强，所述免疫是以糖缀合物为目标。优选地，但非限制性地，诱导的针对糖缀合物的体液免疫水平与对受试者给予本发明的组合物之前针对糖缀合物的体液免疫水平相比至少大四倍、八倍或十倍，优选至少大16倍。借助适当的体外试验或体内试验，还可以定性地测量免疫应答，其中受试者的感染性疾病或其症状的进展受到抑制或有所缓解被认为是诱导了治疗性免疫应答。如本申请中使用的，术语"治疗"和"疗法"可以是指可用于预防、治疗、管理或改善疾病/障碍(例如，细菌感染或与此相关的病况或症状)的任何方案、方法和/或药物。在某些实施方案中，术语"治疗"和"疗法"是指可用于治疗、管理、预防或改善疾病或与之相关的病况或症状、感染或与之相关的病况或症状的生物学疗法、支持疗法和/或其它疗法，如本领域技术人员已知的。如本申请中使用的，术语"治疗剂"和"药物"是指可用于预防、治疗、管理或改善疾病(例如细菌感染或与此相关的病况或症状)的任何药物。优选地，治疗剂是已知可用于或已经用于或目前用于预防、治疗、管理或改善疾病或与之相关的症状(例如，细菌感染或与之相关的病况或症状)的药物。如本申请中使用的，在对受试者给予疗法以应对疾病的情况下，术语"治疗"、"处理"或"处置"是指根除、减轻或改善所述疾病/障碍(例如，细菌性病症)的症状。4.附图简述图1显示合成n-酰化的糖缀合物的一般方法的示意流程图，其中n=重复单位个数，所述重复单位的个数随低聚糖/多糖的类型变化，并且可以是i-i，000或更大。图2显示多糖_蛋白质缀合的一般方法的示意流程图，例如通过n-戊烯酰化制备a群链球菌多糖-蛋白质缀合物。n=重复单位的个数，其取决于多糖或低聚糖的性质，并且可以是l到l，ooo或更大。图3描绘了天然的和经过修饰的a群链球菌多糖的600腿？h-nmr谱。图4显示多糖_蛋白质缀合的一般方法的示意流程图，例如通过n-戊烯酰化制备脑膜炎球菌b多糖-蛋白质，其中n=重复单位的个数。图5描绘了经过修饰的脑膜炎球菌b多糖的600mhz力-nmr谱。图6显示在balbc小鼠中通过用a群链球菌多糖_破伤风类毒素缀合物接种所产生的针对多糖的免疫应答。图例免疫前在用缀合物免疫之前的针对a群链球菌多糖的血清igg浓度。gasp-tt:在用a群链球菌多糖_蛋白质缀合物免疫之后的针对a群链球菌多糖的血清igg浓度，所述缀合物是通过常规方法制备的(将天然的多糖还原并且通过温和的na-偏高碘酸盐氧化作用生成每个多糖分子仅一个的活性部位)。n-but-gasp-tt(l):在用a群链球菌多糖_蛋白质缀合物免疫之后的针对a群链球菌多糖的血清igg浓度，所述缀合物是通过新方法制备的(通过对天然的多糖进行n-戊烯酰基化和氧化，使每个多糖分子生成多个活性部位)。glcnac残基的大约5-10x被戊烯酰基化。n-but-gasp-tt(2):在用a群链球菌多糖_蛋白质缀合物免疫之后的针对a群链球菌多糖的血清igg浓度，所述缀合物是通过新方法制备的(通过对天然的多糖进行n-戊烯酰基化和氧化，使每个多糖分子生成多个活性部位)。glcnac残基的大约15_20%被戊烯酰基化。5.发明详述总的说来，本发明提供以下物质的制备方法(i)不饱和的微生物用n-酰基衍生物低聚糖或多糖；(ii)由与载体蛋白共价结合的所述不饱和的n-酰基衍生物多糖或低聚糖得到的新颖的免疫原性缀合物；以及(iii)包括本发明的分子和药学上可接受的载体的免疫原性糖缀合物组合物。本发明另外包括将这些组合物用作疫苗的方法。如本文中公开的，本发明提供可以促进每个低聚糖或多糖生成多个活性部位的方法，特别是用于与一种或多种蛋白质(例如，载体蛋白质)缀合。本发明还提供形成具有多个活化位置的低聚糖或多糖的方法，所述低聚糖或多糖在与一种或多种适当的载体蛋白质缀合时产生与现有技术先前已知的制备方法相比效率得到增强的交联的糖缀合物疫苗。在某些实施方案中，本发明的方法还产生表现出与本领域中已知的相似疫苗相比表现出免疫原性增强的糖缀合物疫苗。本文中提供的方法还适用于任何包含至少一个氨基糖的多糖，这是优于现有的需要在糖链中具有两个相邻的游离羟基的高碘酸盐氧化方法的显著的优点。使包含具有n-乙酰基的至少一种氨基糖的低聚糖或多糖(例如但不限于包括一个或多个glcnac、mannac、galnac和/或唾液酸的那些)经过处理，以便将一个或多个n-乙酰基脱乙酰化，在低聚糖或多糖中产生一种，优选多种包含伯氨基的氨基糖。然后使所述至少一个伯氨基用n-酰基部分取代，使每个多糖或低聚糖分子产生至少一个，优选多个的活性部位。为了允许进行随后的氧化，使用至少5-碳不饱和脂肪链进行所述n-酰化(例如，戊烯酰化)。本发明还包括使用长度大于5个碳的不饱和脂肪链(例如，6、7、8、9、10、11、12、13或14或更多碳数的不饱和脂肪链)，条件是所述不饱和位置不在所述部分的碳1和碳2之间或碳2和碳3之间(参见图1或式i，在醛基碳和&的q之间或在&的q和c2之间)。因为氧化可以将多糖或低聚糖链裂解，所以本发明所包括的氧化方法经过选择(如本文中所述的和/或本领域中已知的)，以便仅氧化不饱和脂肪链的不饱和位置。这种氧化条件在本领域中通常称为"温和的"并且可以通过常规的实验来确定。因此，本发明的方法包括在温和条件(例如，在强缓冲的溶液中、使用约4t:约27t:的温度范围和约4约9.5的ph范围)下使用氧化不饱和基团的氧化剂(例如，使用03(进行臭氧分解)或h^)，以在所述烃基部分的不饱和位置产生活性醛(-cho)基团。在某些实施方案中，烃基部分的不饱和位置处于烃基主链末端的两个碳之间。双键的氧化使主链烷基链在不饱和位置裂解并且在新的烷基链末端产生活性醛基团。例如，在其中不饱和脂肪链是在c;和c5之间具有单个双键的c5链时，氧化将产生在c4位置具有醛的4个碳的链。在其中不饱和脂肪链具有不止一个双键(即，不饱和位置)的实施方案中，氧化反应可以影响一个不饱和位置或所有两个不饱和位置；然而因为反应使主链碳链裂解，醛基总是处于新形成的脂肪链的末端。因此，在包括不饱和基团的主链具有不止一个不饱和位置时，氧化反应可以产生不同长度(分别取决于是一个不饱和位置还是所有的不饱和位置被氧化，以及取决于双键的位置)的不饱和或饱和的n-酰基，然而，每个部分在脂肪族主链的末端包括一个活性醛基团。本发明的多糖或低聚糖通过本文中所述的和/或本领域中已知的任何方法(例如，还原胺化)与载体蛋白缀合，以产生免疫原性糖缀合物。一般方法的示意流程图显示在图1中。因此，本发明涉及式i的微生物的不饱和n-酰基衍生物低聚糖或多糖13其中&是包括至少一个不饱和碳的不饱和c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c1q或cu烃基部分，fsugar子表示多糖或低聚糖的所述一个或多个氨基糖。在某些实施方案中，所述一个或多个氨基糖是多糖或低聚糖的重复单位的组分。在其它实施方案中，所述一个或多个氨基糖不是多糖或低聚糖的重复单位的组分。尽管本发明包括含多个不饱和碳(即，多个双键)的rp根据本文中提供的方法，ri只需要具有单个的不饱和碳(即，单个双键，该双键不处于&的q和c2之间)。在本发明的某些实施方案中，式i的&是包括单个双键的不饱和c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10或cu烃基部分。在本发明的另外的实施方案中，式i的&是不饱和c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c1q或cn烃基部分，且所述双键的位置处于脂肪链末端的两个碳之间。在特定的实施方案中，不饱和的n-酰基部分被氧化为醛基(在烃基部分的主链的末端)，在与载体蛋白缀合时用作连接体。n-酰基部分上的醛基然后可以通过本领域中已知的和/或本文中描述的任何缀合方法(例如，通过还原胺化)与载体蛋白连接。在又一个实施方案中，氨基(=nh)基团连接于低聚糖或多糖的糖残基的任何位置上，包括糖的1、2、3、4或5位。氨基糖的结构为本领域中公知的，因此，所述连接的位置可以按照惯例确定。例如，在氨基糖是glcnac时，糖的n-乙酰基处于碳2位，而在氨基糖是唾液酸时，糖的n-乙酰基处于碳4位。可用于本发明的经过修饰的式i的多糖(例如，n-酰基衍生物多糖)的非限制性实例是n-戊烯酰化衍生的多糖，包含至少一个n-戊烯酰基(ch2=ch-ch2-ch2-c0nh_)基团，如以下式iii中所示-sugar"、cch:ch一其中n-戊烯酰基用作缀合蛋白质的连接体。可以采用任何缀合模式来使经过修饰的低聚糖或多糖与载体蛋白缀合。一个示例性的方法(其依靠存在于末端邻位的羟基来形成活性醛基)描述在美国专第4，356，170号('170专利)中，所述专利被全文并入本文作为参考)。'170专利描述了将末端醛基引14入到多糖中并通过还原胺化使醛基与蛋白质氨基偶联。由此通过以下式ii中所示的基团(方框中)使多糖和蛋白质连接其中r2是饱和的c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9或c1q烃基部分，并且其中方框内的nh是所述蛋白质的伯叫基团，(例如，赖氨酰基或精氨酰基残基的伯氨基)。式ii的fsugar]表示多糖或低聚糖的所述一个或多个氨基糖。在某些实施方案中，所述一个或多个氨基糖是多糖或低聚糖的重复单位的组分。在其它实施方案中，所述一个或多个氨基糖不是多糖或低聚糖的重复单位的组分。可以在小鼠中体内检验所得到的本发明的n-酰化的多糖-蛋白质缀合物，并且通常表现出具有与本领域中已知的n-丙酰化多糖(例如，在美国专利第5，902，586号；被全文并入本文作为参考中描述的那些)相比得到改善的免疫原性性质。因此，可以预期本发明的疫苗可用于对抗由b型脑膜炎奈瑟球菌或大肠杆菌k1生物体引起的脑膜炎。特别的利益在于保护大部分处于细菌感染(例如，细菌性脑膜炎)危险之中的受试者，例如无免疫应答的个体和婴儿。在本发明的特定的非限制性实施方案中，期望包括不止一种的低聚糖或多糖和/或不止一种的载体蛋白，以便优化免疫应答。这种方法对于预防或治疗以快速发生导致逃避免疫应答的突变为特征的感染(例如，原生动物感染)可能是特别有利的。此外，本发明的免疫原性糖缀合物可以包括不止一种的免疫原性/抗原性结构域和/或不止一个抗原表位。例如，本发明包括多价缀合物，其中对于不同的抗原为特异性的至少两种不同的多糖或低聚糖与单个的载体分子缀合，和/或其中对于不同的抗原为特异性的两种不同的多糖或低聚糖被合并为与载体蛋白缀合的单独的多糖或低聚糖分子。本发明另外包括含多种多糖或低聚糖和/或多种载体蛋白的缀合物。因为本发明的方法使每个多糖或低聚糖分子产生至少一个并且优选多个活性部位，所述多糖或低聚糖可以在一个或多个位置上共价结合于载体蛋白；另外，多糖或低聚糖可以结合于一个或多个载体蛋白。因此，在某些实施方案中，所述缀合物是多糖分子和载体蛋白质的点阵(lattice)。在本发明的糖缀合物组合物中使用的多糖或低聚糖可以具有不同的大小。如本文中定义的，在本发明中使用的低聚糖包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个重复单位(例如，糖残基)并且优选具有10约50个重复单位。如本文中定义的多糖大于50个重复单位，并且可以有约600约2，000个重复单位那么大或更大。在一些情况中，期望大的构建体来增强免疫原性。本发明的方法提供了非常大的多糖的用途，因为可以将许多活性部位引入到单个多糖中。蛋白质5.1多糖及其分离适合用于优选实施方案的多糖包括得自被囊细菌的多糖和低聚糖。所述多糖和低聚糖可以来自于任何来源，例如，可以产生自天然存在的细菌、基因工程细菌，或者可以合成生产。多糖和低聚糖可以在活化之前经过一个或多个处理步骤，例如，纯化、官能化、使用温和的氧化条件解聚、脱乙酰化等。如果需要还可以进行后处理步骤。可以使用本领域中已知用于合成、制备和/或纯化适合的多糖和低聚糖的任何适当的方法。根据本发明的方法使用的多糖和低聚糖包括但不限于血清型为例如1、2、3、4、5、6b、7f、8、9n、9v、ioa、iia、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f和33f型的肺炎球菌多糖；血清型为a、b、c、w135和y的脑膜炎球菌多糖；b型流感嗜血杆菌、多糖多核糖基核糖醇磷酸酯、血清型为iii和v的b群链球菌多糖和伤寒沙门氏菌vi多糖。肺炎球菌和b群链球菌血清型、以及脑膜炎球菌血清群的其它多糖也适合于本发明的用途，同样其它典型地不依赖t的多糖和低聚糖抗原也是适合的，例如得自a群链球菌、葡萄球菌、肠球菌、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、大肠杆菌、绿脓假单胞菌和炭疽杆菌(bacillusanthracis)的多糖或低聚糖。尽管特别优选细菌的多糖和低聚糖，但是也可以使用阴性细菌的脂多糖和低聚脂多糖和它们的多糖和低聚糖衍生物、以及病毒的多糖和低聚糖。通过本领域中已知的方法从细菌荚膜分离多糖。例如，在一个这种方法中，使例如b群脑膜炎球菌(菌株981b)的细菌在发酵罐中在37t:生长，每升蒸馏水使用30克的脱水的toddhewittbroth(difcolaboratories，detroit,mich.)。在发酵罐生长之前，最初使冻干的菌株在烛罐中，在37t:，在5%(v/v)的she印bloodagar(difcolaboratories,detroit，mich.)板中生长。然后将细菌转移到在锥形瓶中的1.0升toddhewittbroth(如上所述)上，将其以190r.p.m在37t:摇动7小时。然后将接种物转移到发酵罐中。在发酵罐生长(16小时)之后，通过添加最终浓度0.75%的福尔马林杀死细菌。通过连续的离心除去细菌，并从上层清液分离多糖并基本上如bundle等人，j.biol.chem.，249，4797-4801(1974)所述进行纯化，不同之处在于通过将粗制的多糖的溶液与冷(4°c)的而不是热(50-60°c)的90%苯酚搅拌来提取蛋白质。后一种处理确保了产生多糖的高分子量形式，例如b群脑膜炎球菌多糖(gbmp)的高分子量形式。在其它特定的实施方案中，可以通过在包含浓度为37g/升蒸馏水的脑心浸液(bhi)(difcolaboratories,detroit,mich.)的发酵罐中在37"c培养从细菌(例如，大肠杆菌(018:k1:h7)(nrcc4283))分离多糖或低聚糖。操作培养物可以从冻干的原料开始，将原料重构并在锥形瓶中在50mlbhi溶液(同上)中初始培养，将锥形瓶以200r.p.m在37t:摇动7小时。然后将培养物转移到1.5升的bhi(如上)中并使其在与如上所述相同的条件下生长7小时。然后将接种物转移到发酵罐中。在这些条件下培养的细菌(例如，大肠杆菌k1)的荚膜多糖的分离和纯化可以通过本领域中已知的和/或本文中所述的任何方法进行。应该理解，上述的分离和纯化方法并不是可以采用的唯一的方法，还有其它公布的方法可用，例如由watson等人，j.immunol,81，331(1958)和上述美国专利第4，727，136号描述的那些；所述文献各自被全文并入本文作为参考。5.2低聚糖或多糖的n-乙酰基的取代天然的低聚糖或多糖的n-乙酰基可以被取代，以在分子的唾液酸残基部分中提供反应性的胺基。所述取代可以通过任何已知的方法进行，例如通过碱(例如，在碱性含水介质中)在高温(例如，约90°c-ll(tc)和在约13-14的ph。在某些实施方案中，取代包括将n-乙酰基脱乙酰化以形成伯氨基。所述碱性的含水介质可以包括碱性金属氢氧化物水溶液，例如，约2m浓度的氢氧化钠。或者，可以使用肼的水溶液。根据本发明，可以使用的碱的非限制性实例是naoh、k0h、lioh、nahc03、na2c03、k2c03、kcn、et3n、nh3、h2n2h2、nah、naome、naoet或kotbu。诸如naoh、koh、lioh、nah、naome或kotbu的碱在0.5n-5.on的范围内使用时最有效。诸如nahc03、na2c03、k2c03和kcn的碱可以以其溶解度允许的浓度使用。诸如朋3或112^112的碱可以以差不多任何浓度(包括100%)使用。可以使用诸如水、醇(优选c「c;)、二甲亚砜、二甲基甲酰胺的溶剂或这些和其它有机溶剂的混合物。最优选包括水的碱溶液。在特定的实施方案中，取代多糖或低聚糖的n-乙酰基的优选ph范围为约9约14，最佳ph为约12。其后，通过本领域中已知的标准方法使用膜或透析进行超提纯而从残余的试剂纯化经过n-取代的多糖。n-乙酰基取代的程度可从低聚糖或多糖的至少一个n-乙酰基的取代到100%的n-乙酰基被取代变化。在某些实施方案中，n-乙酰基取代的程度为约2%、约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%。优选地，天然的n-乙酰基的90-99%被取代。被取代的低聚糖或多糖通过例如冷却、中和、纯化和冷冻干燥来回收。关于n-乙酰基取代的程度以及被取代产物的纯化的分析可以通过本领域中已知的和/或本文中所述的任何方法来进行。例如，可以使用spectra/por⑧membrane丽co:3，500使低聚糖和/或多糖相对于去离子水进行透析，以便进行纯化/回收。可以通过本领域中公知的方法通过500mhz的力-nmr来分析n-脱乙酰的程度。在n-乙酰基取代操作之前，天然的低聚糖或多糖具有宽范围的平均分子量，例如，在约1，000到约1，000，000道尔顿的范围内，通过n-乙酰基取代反应使该平均分子量显著减小。例如，b群脑膜炎球菌多糖(gbmp)具有约500，000约800，000道尔顿的平均分子量；在根据本发明的方法进行n-乙酰基取代之后，通常产生平均分子量为约3，000约50，000道尔顿的n-乙酰基被取代的多糖的片段。全长的多糖或多糖片段都可以用于本发明的方法。例如，全长的多糖或低聚糖可以经过分段以产生更适合于缀合物疫苗的大小。例如，采用平均分子量为10，000-40，000道尔顿，优选约10，000约15，000道尔顿的n-酰化物质。可以通过本领域中已知的任何方法来获得期望大小的片段，所述方法包括例如，离心或过滤的方法。在某些实施方案中，可以通过使用分馏柱，实现期望的分子量范围的大小分级或分离，例如，从已经引入原材料(例如，n-酰化的gbmp物质)的筛分柱(sizingcolumn)(例如，分子筛)的洗脱物收集级分。在某些实施方案中，收集具有较高平均分子量的(例如在30，000-40，000道尔顿的范围内)n-酰化的物质，将其用于本发明的方法。然后将n-乙酰基取代的多糖片段或全长多糖n-酰化，以产生相应的n-酰化产物。所述n-酰化可以如下进行，在温和的碱性条件下，将n-乙酰基取代的多糖溶解在含水的经过缓冲的介质中。优选地，这种温和的经过缓冲的水溶液具有约7.5-9.0的ph。然后将酰基试剂加入到包含糖的溶液中并冷却到低于l(tc，直到反应完成。酰基试剂基于缀合17完成时所期望的烷基(例如，式ii中的期望的r》来选择。酰基试剂的不饱和位置会被氧化为活性醛并因此决定&的长度。例如，酰基试剂可以是不饱和的酰基酸酐(乙酸酐或丙酸酐)或不饱和的酰基卤(例如戊烯酰基氯)。任选地将反应与醇混合，以提高溶解度。如果需要，可以通过本领域中已知的任何方法纯化反应介质。可以使用的纯化方法的非限制性实例是透析并随后通过冷冻干燥回收n-酰化的产物。反应基本上在约10-20小时内完成。然后通过本领域中已知的分析方法测定n-乙酰基的n-酰化程度，例如高分辨率(例如，500mhz)的111nmr，并且优选n-酰化程度最低为90%、更优选约100%。所述n-酰化反应不会产生片段的任何显著的分子量减小。5.3载体蛋白选择与多糖缀合的蛋白质，以将对疫苗的糖组分的不依赖t细胞的免疫应答转化为t细胞依赖性的免疫应答。在本发明的某些实施方案中，载体蛋白可以是天然的毒素或去毒的毒素(即，类毒素)。另外，还可以使用蛋白质毒素的无毒的突变形式。优选地，这种突变保持天然毒素的抗原表位。这种突变的毒素已经被称为"交叉反应物质"或crm。crm197与活性白喉毒素相比仅有单独的氨基酸变化，并且与该活性毒素在免疫学上不可区分。crm197已经作为流感嗜血杆菌缀合物疫苗的组分广泛用于婴儿。将活化的多糖或低聚糖与蛋白质偶联，得到缀合物疫苗。适合的蛋白质包括细菌毒素，该毒素是已经通过化学或基因手段被赋予适合于对受试者给予的安全性的免疫有效的载体。实例包括灭活的细菌毒素，例如白喉类毒素、crm^、破伤风类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌lt、大肠杆菌st和得自绿脓假单胞菌的外毒素a。还可以使用细菌外膜蛋白质，例如，外膜复合物c(ompc)、膜孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白质、肺炎球菌溶血素(pneumolysis)、肺炎球菌表面蛋白a(pspa)、肺炎球菌粘附素蛋白(psaa)或肺炎球菌表面蛋白bvh-3和bvh-11。还可以使用其它蛋白质，例如炭疽杆菌的保护性抗原(pa)、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(klh)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白(bsa)和经过纯化的结核菌素蛋白衍生物(ppd)。优选蛋白质是无毒的和非-致反应的并且可以以适合于优选实施方案的缀合方法的充分的量和纯度得到的蛋白质。例如，可以从白喉棒状杆菌(corynebacteriadiphtheriae)的培养物纯化得到白喉毒素并且使用甲醛化学去毒，以得到适合的蛋白质。载体蛋白的非限制性实例包括破伤风毒素/类毒素、crm197、ca、cp蛋白质(例如，得自b群链球菌，包括非iga结合c-l3蛋白)、白喉类毒素、a溶血素或panton-valentine杀白细胞毒素(pvl)、得自革兰氏阴性菌的外膜蛋白，例如脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白、高分子量蛋白质、得自未分型流感嗜血杆菌的p6和p4，得自粘膜炎莫拉氏菌的cd和uspa、白喉毒素/类毒素、去毒的绿脓假单胞菌毒素/类毒素a、霍乱菌毒素/类毒素、百日咳毒素/类毒素、产气荚膜梭菌外毒素/类毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、轮状病毒vp7蛋白质、呼吸道合胞病毒f、g蛋白、霍乱菌毒素亚单位b、pneumolysoid、百日咳类毒素、包含赖氨酸或半胱氨酸残基的人工合成蛋白质等等。载体蛋白可以是天然蛋白质、经过化学修饰的蛋白质、去毒的蛋白质或重组蛋白质。就蛋白质组分而言，根据本发明制备的缀合物分子可以是单体、二聚体、三聚体和更高度交联的分子。本发明提供了产生缀合物分子的能力，在所述缀合物分子中载体蛋白连接于包含n-乙酰基的多糖或低聚糖。多糖或低聚糖的大小可以显著变化。一种或多种多糖或低聚糖18可以与一种或多种蛋白质交联。本发明的缀合物优选是点阵结构。5.4缀合物本领域中已知许多将活化的多糖(即，包括至少一个必需被赋予能够共价结合于蛋白质的部分)缀合于蛋白质的方法，并且它们适合于本文中的应用。例如，授权给je皿ings的美国专利第4，356，170号描述了，使用氰基硼氢化物进行还原胺化使包含活性醛基的多糖与载体蛋白缀合。本发明的方法允许每个多糖或低聚糖分子产生至少一个，优选多个活性部位(即，活性醛基)。活化的多糖分子可以与一种或多种载体蛋白反应并与一种或多种载体蛋白形成不止一个连接。因此，在某些实施方案中，缀合物产物可以是各种交联的矩阵式或点阵结构的混合物。在缀合之后，可以通过任何适合的方法纯化缀合物。纯化用于除去未反应的多糖、蛋白质或小分子反应副产物。如本领域中已知的，纯化方法包括超滤、大小排阻色谱法、密度梯度离心、疏水作用层析、硫酸铵分级分离等。在某些实施方案中，不需要纯化，或者可能期望仅微小程度的纯化。缀合物可以根据需要经过浓縮或稀释或者处理为用于药物组合物中的任何适合的形式。5.5药物组合物优选地，组合物(例如，药物组合物)包括药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂与作为活性成分的本文中所述的一种或多种生物活性剂(例如，糖缀合物、低聚糖、多糖、多肽或肽)的混合物。包含生物活性剂作为活性成分的药物组合物的制备是本领域中公知的。典型地，这种组合物制备为液体溶液或悬浮液，然而还可以制备适合于在给药之前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。制备物还可以被乳化。活性的治疗用成分经常与药学上可接受的且与活性成分相容的赋形剂(例如，渗透促进剂)混合。适合的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，及其混合物。优选的本发明的载体、赋形剂和稀释剂包括生理盐水(即，0.9xnacl)。另外，如果需要，组合物可以包含增强活性成分的有效性的微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂。本发明的组合物包括可用于生产药物组合物的散装药物组合物(例如，不纯的或未经灭菌的组合物)和可用于制备单位剂型的药物组合物(即，适合于对受试者或患者给药的组合物)。这种组合物包括预防或治疗有效量的本文中公开的预防剂和/或治疗剂或那些药物与药学上可接受的载体的组合。在某些实施方案中，本发明的组合物包括免疫原性量的至少一种免疫原性糖缀合物和任选的药学上可接受的载体。在其它实施方案中，本发明的组合物包括预防或治疗有效量的至少一种免疫原性糖缀合物和任选的药学上可接受的载体。在特定的实施方案中，术语"药学上可接受的"是指生理学相容的。优选地，药学上可接受的是指由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其它通常已知的药典中列举的用于动物(更特别用于人)的。术语"载体"是指将治疗剂与其一起给药的稀释剂、赋形剂、渗透促进剂(在如上所述的本领域中)或媒介物。这种药物载体包括但不限于灭菌的液体，例如水和油类，包括由石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。常见的适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以包含微量的润湿剂或乳化剂或ph缓冲剂。这些组合物可以为溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放的制剂等形式。包括如上所述的免疫原性糖缀合物的本发明的药物组合物在本文中被称为"疫苗"。术语疫苗用于表明本发明的组合物可用于诱导预防性或治疗性免疫应答。本发明的疫苗可以包括具有单独的抗原性结构域或抗原表位的糖缀合物，或者具有多个抗原性结构域或抗原表位的糖缀合物。另外，疫苗可以包括具有单个抗原性结构域或抗原表位或具有多个抗原性结构域或抗原表位的糖缀合物的混合物或前述物质的任何组合。包括本发明的缀合物疫苗的药物组合物可以提供优于常规疫苗的多种优点，包括增强弱免疫原性抗原(例如，细菌的多糖或低聚糖)的免疫原性、所用抗原的量的潜在减小、较低频率的加强免疫、改善的效力、免疫性的优先剌激或免疫反应的潜在靶向。包括一种或多种本发明的免疫原性糖缀合物的疫苗组合物可以经皮、皮下、皮内、静脉内、肌肉内、非肠道、肺内、阴道内、动脉内、经鼻、经口或局部给药。疫苗组合物可以通过注射、粒子轰击、经口或通过气雾剂来递送。本发明的疫苗组合物可以另外包括各种另外的物质，例如药学上可接受的载体。适合的载体包括任何标准药学接受的载体，例如，磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液或甘油三酯乳液)、各种类型的润湿齐u、片齐u、包衣片剂和胶囊。可用于化合物的静脉内和腹膜内给药的可接受的甘油三酯乳液的实例是商业上被称为intralipid.rtm.的甘油三酯乳液。典型地，这种载体包含赋形剂，例如淀粉、奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸、滑石、植物脂肪或油类、树胶、二醇或其它已知的赋形剂。这种载体还可以包括矫味剂和着色附加料或其它成分。本发明的疫苗组合物还可以包括适合的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂(例如，磷酸铝、氢氧化物或硫酸盐)和/或载体。这种组合物可以为液体或冻干或以其它形式干燥的制剂的形式，并且可以包括不同缓冲能力(例如，tris-hcl、乙酸盐、磷酸盐)、ph和离子强度的稀释剂；用于防止吸附于表面的添加剂，例如白蛋白或明胶；洗涤剂(例如，吐温20、吐温80、pluronicf68、胆汁酸盐)；增溶剂(例如，甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如，硫柳汞、苄醇、对羟基苯甲酸酯类)、增量剂或张力调节剂(例如，乳糖、甘露糖醇、山梨糖醇)、聚合物(诸如聚乙二醇)与蛋白质的共价连接、与金属离子的络合或将物质掺入到聚合化合物(例如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等)的粒状制备物中或结合在该聚合化合物的粒状制备物上、或结合在脂质体上、微乳状液、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球状体上。这种组合物会影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放的速率、以及体内清除速率。组合物的选择取决于疫苗的物理和化学性质。例如，由多糖和/或载体蛋白的膜结合形式所衍生的产物可能需要包含去污剂的制剂。控制释放或持续释放组合物包括在亲脂性储库(例如，脂肪酸、蜡、油类)中的制剂。本发明的组合物的其它实施方案结合了用于各种给药途径(包括肌肉内、非肠道、经肺、经鼻和经口的途径)的颗粒形式保护涂层、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂。本发明的组合物可以配制成中性形式或盐的形式。药学上可接受的盐包括但不限于与例如产生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些阴离子所形成的那些盐以及与产生自例如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些阳离子所形成的那些盐。本发明的组合物(例如，疫苗)可以另外包括一种或多种佐剂，以便增强组合物的免疫原性效力。所用的佐剂可以是本领域中已知适合与基于多糖的疫苗使用的任何佐剂(参见，例如，美国专利第5，773，007号，被全文并入本文作为参考)。适合的佐剂包括但不限于水包油型乳液制剂(包含或不包含其它特异性免疫剌激剂，例如胞壁酰基肽或细菌细胞壁组分)，诸如例如，(a)mf59.tm.(wo90/14837;在vaccinedesign:thesubunitandadjuvantapproach,eds.powell緒ewman，plenumpress1995中，第io章)，其包含5%的角鲨烯、0.5%吐温80和o.5x司盘85(任选地包含mtp-pe)，使用微流化器将其配制为亚微粒子，(b)saf，包含10%角鲨烷、0.4%吐温80、5%pluronic-嵌段共聚物l121和thr-mdp，微流化为亚微米乳液或经过涡旋以产生较大粒径乳液，和(c)ribi.tm.佐剂系统(ras)，(ribiimmunochem，hamilton，mont.)，包含2%角鳖烯、0.2%吐温80和一种或多禾中细菌细胞壁组分(例如，单磷酰脂质a(mpl)、海藻糖二霉菌酸酯(tdm)和细胞壁骨架(cws)，优选mpl cws(detox.tm.))。其它佐剂包括皂甙佐剂(例如qs21或stimulon.tm.(cambridgebioscience,worcester,mass.)或由其产生的粒子，例如iscom(免疫剌激性复合物)，所述iscom可以不含另外的去污剂，例如wo00/07621);完全弗氏佐剂(cfa)和弗氏不完全佐剂(ifa);细胞因子(例如，白细胞介素(例如il-i，il-2，il-4，il-5，il-6，il_7，il-12(w099/44636)等)，干扰素(例如，y干扰素)、巨噬细胞集落剌激因子(m-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)等)；单磷酰脂质a(mpl)或3-0-脱乙酰化的mpl(3dmpl)(例如gb-2220221、ep-a-0689454，在与肺炎球菌的糖一起使用时任选地在基本上没有明矾的存在下，例如wo00/56358);3dmpl与例如qs21和/或水包油型乳剂的组合物(例如ep-a-0835318，ep-a-0735898，ep-a-0761231);包括cpg基序的寡核苷酸(kriegvaccine2000，19，618-622;kriegcurropinmolther20013:15-24;roman等人，nat.med，1997，3，849-854;weiner等人，pnasusa，1997，94，10833-10837;davis等人，j.immunol,1998，160，810-876;chu等人，j.exp.med，1997，186，1623-1631;lipford等人，ear.j.immunol,1997,27,2340-2344;moldoveami等人，vaccine,1988，16，1216-1224，krieg等人，nature,1995，374，546-549;kli丽n等人，pnasusa，1996，93，2879-2883;ballas等人，j.immunol,1996，157，1840-1845;cowdery等人，j.immunol,1996，156，4570-4575;halpern等人，cellimmunol,1996，167,72-78;yamamoto等人，jpn.j.cancerres.，1988,79,866-873;stacey等人，j.immunol,1996，157,2116—2122;messina等人，j.immunol,1991，147，1759-1764;yi等人，j.immunol,1996，157，4918-4925;yi等人，j.immunol,1996，157,5394-5402;yi等人，j.immunol,1998，160，4755-4761;以及yi等人，j.immunol,1998，160,5898-5906;国际专利申请w096/02555，w098/16247，w098/18810、w098/40100、w098/55495、w098/37919和w098/52581]即，包含至少一个cg二核苷酸，其中胞嘧啶是未甲基化的)；聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(例如w099/52549);与辛苯昔醇组合的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂(w001/21207)或与至少一种另外的非离子型表面活性剂(例如辛苯昔醇)组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(w001/21152);皂甙和免疫剌激性寡核苷酸(例如cpg寡核苷酸)(w000/62800);免疫剌激剂和金属盐粒子(例如wo00/23105);皂甙和水包油型乳剂，例如w099/11241;皂甙(例如qs21) 3dmpl im2(任选地 甾醇))，例如，w098/57659;以及/或起到免疫剌激剂作用以增强组合物效力的其它物质。21药物组合物可以包含用于接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如ph调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的抗原浓度可以广泛地不同(例如，以重量计，低于约0.1%，通常为至少约2%_多达20%_50%以上)并且根据所选的具体给药方式和患者的需要，主要通过用液量、粘度、体重等来选择。所得到的组合物可以是溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、凝胶、霜剂、洗剂、膏剂或气雾剂的形式。根据优选实施方案制备的缀合物可以以适合于治疗和/或预防感染性疾病的形式并以免疫有效剂量对受试者给药。本申请中使用的术语"受试者"是指动物，例如哺乳动物。例如，所考虑的哺乳动物包括人、灵长类动物、狗、猫、羊、牛、山羊、猪、马、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等。术语"受试者"、"患者"或"宿主"可互换地使用。如本申请中使用的，缀合物疫苗的"免疫有效"剂量是适合于引起免疫应答的剂量。特定的剂量取决于要治疗的受试者的年龄、体重和医学状况，以及取决于给药方法。适合的剂量可以由本领域技术人员容易地确定。在实施用于治疗和/或预防指定疾病的免疫方案时，将治疗有效量的缀合物对受试者给药。如本申请中使用的，术语"有效量"是指治疗剂(例如，缀合物)或其它活性组分的总量足以表现出对受试者产生有意义的利益，例如，增强免疫应答，相关医学状况(疾病、感染等)的治疗、治愈、预防或改善，或这种状况的治疗、治愈、预防或改善的比例有所增加。在"有效量"适用于单独给药的单一的治疗剂时，该术语是指单独的该种治疗剂。在适用于组合物时，无论组合给药、顺序给药或同时给药，该术语是指引起治疗效果的各成分的总量。如本申请中使用的，短语"以有效量给予"治疗剂是指在用所述治疗剂治疗受试者时，所述治疗剂的量和治疗的时间足以引起反映所述疾病、感染或障碍的严重程度的至少一种指标得到改善、并且优选得到持续的改善。本发明的缀合物疫苗可以作为单剂量给药，或者作为包括一个或多个加强的系列给药。例如，婴儿或儿童可以在早年接受单剂量，然后在直到1、2、3、4、5、6、7、s、9、10年或更长时间之后给予加强剂量。加强剂量从最初的b细胞产生抗体，s卩，回忆应答。缀合物疫苗在婴儿或儿童中引起高的初级功能性抗体应答，并且能够在加强给药之后引起回忆应答，证明由该缀合物疫苗引起的保护性免疫应答是长期有效的。本发明的疫苗可以配制为液体制剂，该制剂用于例如经口、经鼻、经肛门、经直肠、经颊、经阴道、口服、胃内、经粘膜、经舌、经肺泡、经齿龈、经嗅觉粘膜或呼吸道粘膜的给药。适合于这种给药的形式包括悬浮液、糖浆和酏剂。缀合物疫苗还可以配制为用于非肠道给药、皮下给药、皮内给药、肌肉内给药、腹膜内给药或静脉内给药、可注射给药、从植入物持续释放给药或通过滴眼剂给药。适合于这种给药的形式包括灭菌的悬浮液和乳液。这种缀合物疫苗可以与适合的载体、稀释剂或赋形剂混合，所述适合的载体、稀释剂或赋形剂例如是无菌水、生理盐水、葡萄糖等。缀合物疫苗还可以冻干。缀合物疫苗可以包含辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂、胶凝添加剂或粘度增强添加剂、防腐剂、矫味剂、着色剂等，这取决于给药途径和期望的制剂。可以查阅标准教科书，例如"remington:thescienceandpracticeofpharmacy",lippincottwilli咖s&wilkins;20th片反(jim.1，2003)和"remington'spharmaceuticalsciences"，mackpub.co.;第18增补版和第19增补版(分别在1985年12月和1990年6月)，来制备适合的制剂，无需过度的实验，所述文献都被全文并入本文作为参考。这种制剂可以包括络合剂、金属离子、聚合物(例如，聚乳酸、聚乙醇酸)、水凝胶、右旋糖酐等、脂质体、微乳状液、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球状体。用于脂质体制剂的适合的脂质包括但不限于单酸甘油酯、甘油二酯、脑苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂甙、胆汁酸等。这种另外的组分的存在可以影响物理状态、溶解度、稳定性、体内适当的速率和体内清除速率，因此根据预定的应用进行选择，使得载体的特征适合于所选的给药途径。本发明药物组合物与接受者的血液或其它体液优选是等渗的。组合物的等渗性可以使用酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机的溶质来获得。特别优选氯化钠。可以使用缓冲剂，例如乙酸及其盐、柠檬酸及其盐、硼酸及其盐和磷酸及其盐。非肠道媒介物包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化的林格溶液或固定油类。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如，基于林格右旋糖的那些)等。本发明的药物组合物和/或疫苗可以对处于获得疾病或障碍(例如，细菌感染)的危险之中的受试者给药，以用于预防或至少部分抑制疾病和/或与之相关的症状或并发症的进展。用于治疗用途的有效量取决于例如，抗原组成、给药方式、患者的体重和一般健康状态和处方医生的判断。可以给予抗原组合物的单剂量或多剂量，这取决于患者所需要和耐受的剂量和频率、以及给药途径。5.5.l免疫方案本发明的药物组合物和/或疫苗以产生选择性抗多糖或抗低聚糖抗体的方式对宿主给药，优选没有或只有很少的可检测的宿主自身抗体产生。在特定的实施方案中，将本文中所述的疫苗组合物顺序给药。首先，将致免疫有效剂量的本发明的疫苗给予受试者。第一个剂量通常以有效引起免疫应答(例如，活化t细胞)的量给予。首次免疫的量通常为约0.001mg约1.0mg/70千克患者，更通常为约0.oolmg约0.2mg/70千克患者，通常为约0.005mg约0.015mg/70千克患者。可以使用每名患者每天0.001直到约10mg的剂量，特别是在抗原不是给予到血流中的情况中，例如给予到体腔中或器官的内腔中。在经口、经鼻或局部给予时可能使用显著更高的剂量(例如，10-100mg或更高)。在给予第一个疫苗剂量之后，在受试者通过暴露于第一个剂量而已经免疫接触过抗原之后，对受试者给予治疗有效的本发明疫苗的第二剂量。加强可以在首次免疫之后的数天、数周或数月给予，这取决于患者的应答和状况。第一次疫苗给药的免疫应答的存在可以通过已知的方法来确定(例如，在首次免疫之前和之后从个体取得血清，并且证明个体免疫状态的变化，例如，免疫沉淀试验或elisa或杀菌试验或蛋白质印迹或流式细胞计数分析等)和/或证明对第二次注射的免疫应答的程度比使用用于第二次注射剂的物质的组合物进行第一次免疫(例如，初次免疫)的对照动物的免疫应答更高。初次免疫和/或对第一次疫苗给药的免疫应答的存在还可以通过在第一次免疫之后等一段时间来假定，基于先前的经验，所述时间是足以发生免疫应答和/或初次免疫的时间_例如2、4、6、10或14周。第二次免疫的加强剂量典型地为约0.oolmg约1.omg抗原，这取决于免疫原的性质和免疫途径。在某些实施方案中，在个体已经初次免疫和/或对第二个疫苗组合物的免疫应答之后对受试者给予治疗有效剂量的第三个疫苗组合物。所述第三加强免疫可以在第二次免23疫之后的数天、数周或数月给予，这取决于受试者的应答和状况。本发明另外考虑了使用相同或不同的疫苗制剂进行第四、第五、第六或更多次的加强免疫。在某些实施方案中，将抗原组合物给予对于免疫缀合物的多糖或低聚糖的细菌来源为首次进行免疫的哺乳动物受试者(例如，人)。在特定的实施方案中，所述哺乳动物是约5岁或年龄更小的儿童，优选约两岁大或更小，并且在以下时间中的任何一个或多个时间给予所述抗原组合物出生后的二周、一个月、2、3、4、5、6、7、8、9、10或ll个月或一年或15、18或21个月或2、3、4或5岁。在优选实施方案中，在疾病症状的第一个征兆之前开始对任何哺乳动物给药，或者在可能暴露于或实际暴露于感染或疾病(例如，暴露于奈瑟氏球菌或大肠杆菌k1或被奈瑟氏球菌或大肠杆菌k1感染)的第一个征兆时给予。药物或疫苗组合物可以以与剂型相容的方式以治疗有效量给予。给药的量取决于要治疗的受试者、受试者免疫系统利用活性成分的能力和所需的调节程度。要给予的活性成分的确切量取决于医师的判断并且对于每名个体都是特定的。然而，对于人类的婴儿，在本发明的药物组合物内的免疫原性糖缀合物的治疗有效剂量包括每千克体重为约5约7.g、约5约10ug、约5约12.g、约5约15ug、约5约17.g、约5约20iig、约5约25iig、约5约30iig、约5约35iig、约5约40iig、约5约45iig或约5约50iig;以及/或在约1约1.5iig、约1约2iig、约1约2.5iig、约1约3iig、约1约3.5iig、约1约4iig、约1约5iig、约1约6iig、约1约7iig、约1约8iig、约1约9yg或约1约10iig范围内。本发明的药物或疫苗组合物可以与涉及用于人或非人类受试者的目前在使用的或在开发的各种疫苗联合给药。用于人类受试者并且针对感染性疾病的疫苗的实例包括联合的白喉和破伤风类毒素疫苗；百日咳全细胞疫苗；灭活流感疫苗；23-价的肺炎球菌疫苗；麻疹活疫苗；流行性腮腺炎活疫苗；风疹活疫苗；卡介菌(bcg)结核肝菌疫苗；甲型肝炎疫苗；乙型肝炎疫苗；丙型肝炎疫苗；狂犬病疫苗(例如，人二倍体细胞疫苗)；灭活的脊髓灰质炎疫苗；脑膜炎球菌多糖疫苗；四价的脑膜炎球菌菌苗；黄热病活病毒疫苗；杀死的伤寒全细胞疫苗；霍乱菌苗；杀死的日本乙型脑炎病毒疫苗；腺病毒疫苗；巨细胞病毒疫苗；轮状病毒疫苗；水痘疫苗；炭疽菌苗；牛痘疫苗；以及其它市售的和实验的疫苗。5.6治疗应用的表征和证明在人类中使用之前，优选在体外(例如，在细胞培养物系统中)测试，然后在体内(例如，在动物模型生物体中，例如啮齿动物模型系统)测试本发明的药物组合物的若干方面的期望治疗活性。可用于评价对特定的疫苗组合物产生治疗型免疫应答的可能性的分析方法为本领域中公知的。在人用之前，可以在适合的动物模型系统中测试预防剂和/或治疗剂的联合。这种动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、狗、兔等。可以使用本领域中公知的任何动物系统。在本发明的特定的实施方案中，在小鼠模型系统中测试预防剂和/或治疗剂的组合。预防剂和/或治疗剂可以重复给药。操作的几个方面可以变化，例如给予预防剂和/或治疗剂的时间方案、以及这些药物是分别给药还是作为混合物给药。5.7毒性研究可以通过标准的药学操作在细胞培养物或实验动物中测定本发明组合物的毒性和/或效力，例如，确定ld5。(导致群体的50%致死的剂量)和ed5。(在群体的50%中治疗有效的剂量)。毒性效能和治疗效能之间的剂量比值是治疗指数，其可以表示为比值ld5。/ed5。。优选表现出大治疗指数的疗法。尽管可以使用表现出毒性副作用的疗法，但是应该注意，要设计用于将这种药物靶向到患病组织的位置的递送系统，以便使对于未患病细胞的潜在损害最小化，并且从而减少副作用。得自动物研究的数据可用于制定用于受试者的治疗剂量范围。这种药物的剂量优选落入包括ed5。在内的浓度范围内，而只有很少的毒性或没有毒性。所述剂量可以在这个范围内有所变化，这取决于使用的剂型和利用的给药途径。对于在本发明的方法中使用的任何疗法，最初可以从动物分析估算治疗有效剂量。可以在动物模型中制定剂量，以便获得包括在动物模型中确定的ic5。(s卩，实现症状的半数最大抑制作用的试验化合物的浓度)在内的给药的浓度范围。这种信息可用于在受试者(例如，人)中更精确地确定有用的剂量。5.8试剂盒本发明还包括试剂盒，其具有以储存稳定形式存在的、可溶解或可稀释为期望剂量的组合物的单位剂量，以及适当的包装和操纵设备，以便于在滴注之前进行混合和保持无菌。这种试剂盒可以包括，例如，第一容器，其包含储存稳定形式的活性成分，为储备溶液形式的单位剂量或作为冻干的粉末的单位剂量；以及第二容器，其包含分开的或合并的稀释剂或溶剂和稀释剂，该稀释剂或溶剂和稀释剂的体积将提供在适合于给药的体积中的治疗用化合物的单位剂量；源于将稀释剂与储备溶液或冻干的粉末合并在一起的设备；以及任选地的用于对患者给予剂量的设备。用于将稀释剂转移到储备溶液或冻干的粉末中的设备可以包括但不限于注射器或多室容器(其具有使活性成分与稀释剂分开的可裂开的内部密封)。本发明提供包括一个或多个容器的药物包装或试剂盒，所述一个或多个容器填充有本发明的药物组合物或其一部分。另外，还可以在药物包装或试剂盒中包括可用于治疗疾病或障碍的一种或多种其它预防剂或治疗剂。本发明还提供包括一个或多个容器的药物包装或试剂盒，其中所述一个或多个容器填充有本发明的药物组合物的一种或多种成分。任选地，与这种容器结合的可以是由管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，所述通知表明得到关于人类给药的生产、使用或销售的机构的批准。通常，本发明的组合物的成分被单独提供，或共同混合成单位剂型，例如，作为在指示活性剂量的气密容器(例如，安瓿或小药袋)中的干燥的冻干粉末或无水浓縮物。在某些实施方案中，本发明的组合物另外包括增量剂，例如氯化钠、甘露糖醇、聚乙烯吡咯烷酮等，以便提供在冷冻干燥之后容易操纵的足够的物质。本发明提供可用于上述方法的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括一种或多种本发明的药物组合物。在另一个实施方案中，试剂盒例外在一个或多个容器中包括可用于治疗感染性疾病或与之相关的症状的一种或多种其它预防剂或治疗剂。尽管已经通过例如特定的实施方案公开了本发明，但是对于本领域技术人员来说，其它的实施方案、方法、组合物、活性成分、适应症、组合物和试剂盒是显而易见的。所有这种变化和扩展都被包括在本文中公开和要求保护的本发明范围内。6.实施例6.1实施例i:缀合图l提供了本发明的一般方法的示意性流程图。使用碱，使多糖中的至少一个n-乙酰基(例如，来自glcnac、mannac、galnac和唾液酸)被n_酰基部分取代，以形成式i的化合物，随后进行n-戊烯酰基化(使用5-碳不饱和的脂肪链)。然后将得到的经过酰化的化合物氧化，在戊烯酰基的不饱和位置产生活性醛基。然后通过被活化的多糖的还原胺化而使经过氧化的化合物与载体蛋白缀合，产生免疫原性糖缀合物。可以使用动物模型证明产物的免疫原性(如前所述)。对于所有的实验，通过装备有superose12柱的biologicsystem(bio-rad)分析缀合的进展。通过在所述柱的空隙体积中洗脱的通过测量在280nm的uv吸光度监测的峰的递增表明多糖对抗原性蛋白质的缀合。在缀合完成之后，用0.inhc1将溶液中和到ph7，然后相对于pbs进行透析。如下纯化缀合物使缀合物通过superdex200pg(pharmacia)的1.6x60cm柱并用包含0.01%硫柳汞的pbs洗脱。将对应于空隙体积峰值的级分合并。通过dubois等人(51)的苯酚-硫酸分析法和bradford(9)的coomassie分析法估算缀合物中的碳水化合物和蛋白质含量。6.2实施例ii:a群链球菌(gas)多糖-蛋白质缀合物gas多糖的部分(35-40%)n_乙酰某的取代:在室温((rt)，约20-25°c)下，在搅拌下用nabh4(8mg/ml)处理含gas多糖(30mg/ml)的o.012nnaoh75分钟。在搅拌下将3nna0h(0.012nnaoh体积的1/2)加入到反应混合物中，以实现20mg/ml的gas多糖最终浓度。然后将反应混合物在8(tc保持1小时。然后将其冷却到室温并用水稀释到4mg/ml的最终的gas多糖浓度。使用3k再生纤维素膜使其在stir-cell中相对于水进行渗滤。使用15x体积的水进行渗滤，以实现24mg/ml的gas浓度。通过^-nmr光谱法监测具有伯氨基的n-乙酰基的取代程度。n-乙酰基被取代的gas多糖的n-酰化(例如，n_戊烯酰基化)(15-25%):在室温搅拌的情况下，在75分钟内将含4-戊烯酰氯(lml/100mg多糖)的l，4-二噁烷(lml/ml4-戊烯酰氯)滴加到n-乙酰基被取代的gas多糖(24mg/ml)的溶液中。通过滴加3nnaoh保持溶液的ph为6.8_9.5。通过滴加3nnaoh将反应混合物的ph提高到12.7，并在室温搅拌45分钟。然后通过在室温滴加inhc1将反应混合物的ph降低到7.7。将反应混合物用水稀释到4mg/mlgas多糖的最终浓度，并使用3k膜，在stircell中，用水进行渗滤。收集10x体积的水作为渗透物。最后，将渗余物浓縮到24mg/ml的多糖浓度并储存在_20°c。n-乙酰基被取代(例如，n-戊烯酰基化)的gas多糖的任选封端(例如n_乙酰化)(参见图2):在室温下，在75分钟时间内将乙酸酐(0.6ml/100mg多糖)滴加到搅拌的n-戊烯酰基化的gas多糖(24mg/ml)的溶液中。通过滴加3nnaoh保持溶液的ph为6.8_9.5。然后通过滴加3nnaoh将反应混合物的ph提高到12.7，并在室温搅拌60分钟。然后通过在室温滴加1nhcl，将反应混合物的ph降低到7.7。将反应混合物用水稀释到4mg/mlgas多糖的最终浓度，并使用3k膜，在stircell中，用水进行渗滤。收集15x体积的水作为渗透物。最后，将渗余物浓縮到24mg/ml的多糖浓度并储存在-2(tc。通过600mhz力-nmr分析估算多糖中结合的戊烯酰基(参见图3)。26n-酰某被取代(例如，n-戊'琉酰某化)的gas多糖的氧,化(参见图2):在室温下，将甲醇(多糖溶液体积的1/2)缓慢加入到搅拌的n-戊烯酰基gas多糖的水溶液(24mg/ml)中。使用干冰_乙醇浴将混合物冷却到约_15到_20°c。将臭氧(使用臭氧发生器ozomax1从空气产生)鼓泡通过缓慢搅拌的反应混合物40分钟，同时保持温度为-15到-2(tc。然后使氮气鼓泡通过混合物io分钟，以便逐出过量的臭氧。然后将反应混合物用水稀释到5mg/ml多糖的最终浓度，并使用3k膜，在stircell中，用水进行渗滤。收集25x体积的水作为渗透物并将渗余物浓縮到20mg/ml的多糖浓度。然后将其冻干，用于下一步。辆mf,歸/翻論,歸服c白鄉a:将含n-丁氧基(n-buo)gas多糖(96mg/ml，1ml)(得自n_戊烯酰基gas多糖的氧化)的o.2mm磷酸盐缓冲液(ph7.7)加入到破伤风类毒素的磷酸盐缓冲液(ph7.7)溶液(浓度120mg/ml，0.25ml)中。向所述溶液添加氰基硼氢化钠(40mg)，并搅拌反应混合物，以实现均匀的混合物。在温和的摇动下，将反应混合物在37°c保温24小时。在24小时之后，加入另外的16mg的氰基硼氢化钠，并使反应继续进行另外的48小时。在48小时之后，加入另外的4mg氰基硼氢化钠，并将反应在37t:摇动另外的24小时。然后加入含5%硼氢化钠的0.05nnaoh溶液(0.5ml)，并在室温温和地搅拌1小时。然后，在室温下，在搅拌下加入1n的乙酸溶液(0.72ml，分三部分加入)。将反应用pbs(ph7.4)稀释到32ml，并在labscaletff系统中，使用30k膜进行纯化。收集30x体积的渗透物。使渗余物(30ml)过滤通过o.2微米过滤器，并向缀合物溶液中加入含10%硫柳汞的pbs溶液(0.3ml)。将缀合物溶液储存在2-8°c。gas多糖_蛋白质缀合物的组成表示在表1中。6.3实施例iii.脑膜炎球菌b多糖-蛋白质缀合物n-乙酰某被取代的脑膜炎球菌b多糖的n-酰化(例如，n-戊烯酰某化)(15-25%):在室温搅拌的情况下，在75分钟内，将含4-戊烯酰氯(lml/100mg多糖)的1，4-二噁烷(lml/ml4-戊烯酰氯)滴加到n-乙酰基被取代的多糖(24mg/ml)的溶液中。通过滴加3nnaoh，保持溶液的ph为6.8_9.5。然后通过滴加3nnaoh，将反应混合物的ph提高到12.7，并在室温搅拌45分钟。然后通过在室温滴加1nhc1，将反应混合物的ph降低到7.7。然后将反应混合物用水稀释到4mg/ml多糖的最终浓度，并在stircell中，使用3k膜，用水进行渗滤。收集10x体积的水作为渗透物。最后，将渗余物浓縮到24mg/ml的多糖浓度，并储存在_20°c。n-乙酰基被取代(例如，n-戊烯酰基化)的脑膜炎球菌b多糖的任选封端(例如，n-丙烯酰基化)(参见图4):在室温搅拌下，在75分钟时间内，将丙酸酐_乙醇混合物(2.5:1，0.84ml/100mg多糖)滴加到n-戊烯酰基化的多糖(24mg/ml)的溶液中。通过滴加3nnaoh，保持溶液的ph为6.8-9.5。然后通过滴加3nnaoh，将反应混合物的ph提高到12.7，并在室温搅拌60分钟。然后通过在室温滴加1nhcl，将反应混合物的ph降低到7.7。将反应混合物用水稀释到4mg/ml多糖的最终浓度，并在stircell中，使用3k膜，用水进行渗滤。收集15x体积的水作为渗透物。最后，将渗余物浓縮到24mg/ml的多糖浓度，并储存在-2(tc。通过600mh^h-nmr分析估算多糖中结合的戊烯酰基(参见图5)。n-酰某取代(例如，n-戊'琉酰某化)的和仵诜封端(例如，n-丙酰某化)的b群脑腊炎球菌b多糖(gbmp)的氧化(参见图4):在室温搅拌下，将甲醇(多糖溶液体积的1/2)缓慢加入到n-戊烯酰基-n-丙酰基gbmp的水溶液(24mg/ml)中。然后使用干冰_乙醇浴，将混合物冷却到约_15到_20°c。将臭氧(使用臭氧发生器ozomax1从空气产生)鼓泡通过温和地搅拌的反应混合物40分钟，同时保持温度在大约-15到_20°c。然后使氮气鼓泡通过混合物10分钟，以便逐出过量的臭氧。然后将反应混合物用水稀释到5mg/ml多糖的最终浓度，并在stircell中，使用3k膜，用水进行渗滤。收集25x体积的水作为渗透物，并将渗余物浓縮到20mg/ml的多糖浓度。然后将其冻干，用于下一步。与重会目脑腊炎球菌蛋白(rporb)/得自脑腊炎球菌的外腊蛋白(ompc)的缀合:将含活化的n-叔丁酰氧基_(nbuo)n-prgbmp(n-but-[-ch=0]-n-pr-gbmp，17mg/ml，lml)的hepes缓冲液(ph8.5)加入到含rporb/0mpc(浓度为15mg/ml)的hepes缓冲液(ph8.5)溶液中。反应混合物中的蛋白质和多糖的最终浓度是l:3。加入氰基硼氢化钠(多糖质量的0.5倍)，并搅拌反应混合物，以确保混合物均匀。在温和的摇动下，将反应混合物在37t:保温24小时。在24小时之后，再加入氰基硼氢化钠(多糖质量的0.125倍)，并使反应继续另外的48小时。在48小时之后，向混合物加入另外量的氰基硼氢化钠(多糖质量的0.032倍)，并在摇动下将反应在37t:保持24小时。然后加入含5%硼氢化钠的0.05nna0h溶液(原始反应体积的o.2x)，并在室温温和地搅拌1小时。在室温搅拌下，加入1n的乙酸溶液(0.3x的原始反应体积，分三部分加入)。将反应用pbs(ph7.4)稀释，然后在labscaletff系统中，使用30k膜进行纯化。收集30x体积的渗透物。使渗余物过滤通过0.2微米过滤器，并向缀合物溶液中加入含10%硫柳汞的pbs溶液(硫柳汞的最终浓度为0.01%)。将缀合物溶液储存在2-8°c。脑膜炎球菌b多糖-蛋白质缀合物的组成表示在表1中。6.4实施例iv.脑膜炎球菌c多糖-蛋白质缀合物根据如上所述的方法进行n-乙酰基部分的取代、酰化、氧化和与蛋白质的缀合。脑膜炎球菌c多糖-蛋白质缀合物的组成表示在表1中。6.5实施例v.iii型b群链球菌多糖_蛋白质缀合物根据与如上所述相似的实验步骤，进行b群链球菌iii型多糖-蛋白质的活化和缀合。b群链球菌iii型多糖-蛋白质缀合物的组成表示在表1中。表1.多糖-蛋白质缀合物的组成28tableseeoriginaldocumentpage29
6.6实施例vi.用gasp-tt缀合物使balbc小鼠免疫用无水凝胶(anhydrogel)(lmg/ml)配制缀合物(10yg/ml，在pbs缓冲液中)。将缀合物溶液(200ml，2iig当量的缀合多糖)在无水凝胶中的悬浮液以2周的间隔注射到balbc小鼠中。在3次连续注射之后，在最后一次注射之后的1周收集血样。从样品分离血清，并通过elisa量化血清中的抗_多糖抗体。在balbc小鼠中由a群链球菌多糖_破伤风类毒素缀合物诱导的针对多糖的免疫应答的结果表示在图6中。6.7实施例vii.用mengb-rporb缀合物使cdl小鼠免疫用无水凝胶(lmg/ml)配制缀合物(10g/ml，在pbs缓冲液中)。将缀合物溶液(200ml，2iig当量的缀合多糖)在无水凝胶中的悬浮液以2周的间隔注射到cdl小鼠中。在3次连续注射之后，在最后一次注射之后的1周收集血样，并分离血清。通过elisa测定血清中的多糖特异性抗体。通过测量在血清的存在下对巧克力琼脂涂层板中的细菌生长的抑制作用来测定血清的杀菌活性。cdl小鼠中的血清产生的脑膜炎球菌b多糖-rporb缀合物的杀菌活性表示在表2中。在第42和52天放血后的由3个单独批次(根据本发明制备的，分别为批次1到批次3)的npr-(nbuo)-gbmp-rporb缀合物所产生的血清的血清杀菌活性(sba)显著高于从npr-gbmp-rporb缀合物(通过唾液酸链末端的常规还原胺化制备的)产生的血清的sba(参见表2)。认为根据本发明制备的缀合物由于使用了相对较大的多糖部分，实现了改善的免疫应答，所述相对较大的多糖部分在沿着多糖链的多个位置被活化并改善缀合物的交联。表2.cd1小鼠中的血清产生的脑膜炎球菌b多糖-rporb缀合物的杀菌活性
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*血清杀菌活性。应该理解，尽管显示了示例性的实施方案，但是本说明书、特定的实施例和数据只是作为示例给出，而非意在限制本发明。通过本文中所包含的讨论、公开和数据，在本发明内的各种变化和变体对于本领域技术人员来说是显而易见的，因此被考虑为本发明的一部分。权利要求制备免疫原性糖缀合物的方法，其包括a)将包含一个或多个氨基糖的抗原性低聚糖或多糖上的至少一个n-乙酰基脱乙酰化，以形成具有至少一个包含伯氨基的氨基糖的低聚糖或多糖；b)用包含至少4个碳的不饱和烃基部分的n-酰基部分取代所述至少一个伯氨基，其中双键位于所述不饱和烃基部分的除碳1和碳2之间或碳2和碳3之间以外的两个碳之间；c)使所述低聚糖或多糖与氧化剂接触，以在所述烃基部分的不饱和位置产生至少一个活性醛基；以及d)使所述低聚糖或多糖通过所述至少一个活性醛基与载体蛋白缀合，从而产生免疫原性糖缀合物。2.制备免疫原性糖缀合物的方法，其包括a)用包含至少4个碳的不饱和烃基部分的n-酰基部分取代包含一个或多个氨基糖的抗原性低聚糖或多糖上的至少一个n-乙酰基，其中双键位于所述不饱和烃基部分的除碳1和碳2之间或碳2和碳3之间以外的两个碳之间；b)使所述低聚糖或多糖与氧化剂接触，以在所述烃基部分的不饱和位置产生至少一个活性醛基；以及c)使所述低聚糖或多糖通过所述至少一个活性醛基与载体蛋白缀合，从而产生免疫原性糖缀合物。3.权利要求1的方法，其中所述伯氨基被不饱和的n-酰基取代以形成式i:
formulaseeoriginaldocumentpage2其中&是不饱和的c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c1q或cn烃基部分，并且fsugari表示所述-个或多个氨基糖。4.权利要求2的方法，其中所述n-乙酰基被不饱和的n-酰基取代以形成式i:
formulaseeoriginaldocumentpage2其中&是不饱和的c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c1q或cn烃基部分，并且fsugar子表示所述一个或多个氨基糖。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述不饱和的烃基的长度是5个碳。6.权利要求1-4中任一项的方法，其中双键位于所述不饱和烃基部分的末端两个碳之间。7.权利要求5的方法，其中双键位于所述不饱和烃基部分的末端两个碳之间。8.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述不饱和烃基部分具有一个双键，该双键位于所述烃基部分的末端两个碳之间。9.权利要求5的方法，其中所述不饱和烃基部分具有一个双键，该双键位于所述烃基部分的末端两个碳之间。10.权利要求6的方法，其中所述活性醛基处于所述烃基部分的末端部分。11.权利要求7的方法，其中所述活性醛基处于所述烃基部分的末端部分。12.权利要求1或2的方法，其中所述氨基在所述一个或多个氨基糖的1、2、3、4或5位与所述一个或多个氨基糖相连。13.权利要求1或2的方法，其中将包含不饱和烃基部分的所述n-酰基部分氧化，以包含醛基，并且所述n-酰基部分用作使所述低聚糖或多糖与载体蛋白缀合的连接体。14.权利要求1或2的方法，其中通过还原胺化，使所述低聚糖或多糖经由n-酰基部分的醛基与载体蛋白缀合。15.权利要求1或2的方法，其中所述糖缀合物的载体蛋白和低聚糖或多糖通过如下连接共价连接
formulaseeoriginaldocumentpage3蛋白质其中r2是饱和的c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9或c1q烃基部分，其中所述连接的nh是所述蛋白质的伯nh2基团，并且其中fsugar^表示所述一个或多个氨基糖。16.权利要求2的方法，其中用n-戊烯酰基取代所述n-乙酰基，并且其中n-戊烯酰基用作使化合物与载体蛋白缀合的连接体。17.权利要求1或2的方法，其中n-乙酰基是所述一个或多个氨基糖的部分，所述一个或多个氨基糖是glcnac、mannac、galnac和唾液酸中的一个或多个。18.权利要求2的方法，其中使用碱，用n-酰基部分取代所述n-乙酰基，以形成式i。19.权利要求1或2的方法，其中所述载体蛋白是破伤风毒素或类毒素、crm^、得自革兰氏阴性菌的外膜蛋白质、得自不可分类的流感嗜血杆菌的p6和p4、得自粘膜炎莫拉氏菌的cd和uspa、白喉毒素/类毒素、去毒的绿脓假单胞菌毒素a、霍乱菌毒素/类毒素、百日咳毒素/类毒素、产气荚膜梭菌外毒素/类毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、轮状病毒vp7蛋白质或呼吸道合胞病毒f蛋白和g蛋白或其活性部分。20.权利要求1或2的方法，其中所述低聚糖或多糖是得自细菌的低聚糖或多糖。21.权利要求20的方法，其中所述细菌是链球菌、葡萄球菌、肠球菌、芽孢杆菌、棒状杆菌、李斯特菌、丹毒丝菌、梭状芽孢杆菌、嗜血杆菌、志贺氏菌、克雷伯氏菌、霍乱弧菌、奈瑟氏球菌或埃希氏菌。22.权利要求21的方法，其中所述低聚糖或多糖是产生自b群链球菌、a群链球菌、脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌或大肠杆菌的荚膜多糖。23.权利要求22的方法，其中所述荚膜多糖产生自ia、ib、ii、iii、v、vi或viii型b群链球菌。24.权利要求22的方法，其中所述荚膜多糖产生自b、c、y或w135型脑膜炎奈瑟球菌。25.权利要求22的方法，其中所述荚膜多糖产生自ni、iv或xiv型肺炎链球菌。26.权利要求22的方法，其中所述荚膜多糖产生自大肠杆菌k1。27.权利要求1的方法，其中预先将所述载体蛋白与相同或不同的抗原性低聚糖或多糖缀合。28.权利要求2的方法，其中预先将所述载体蛋白与相同或不同的抗原性低聚糖或多糖缀合。29.药物组合物，其包含根据权利要求1、2、27或28的免疫原性糖缀合物和药学上可接受的载体。28.权利要求27的药物组合物，其包含多种低聚糖或多糖。29.权利要求27的药物组合物，其包含多种载体蛋白。30.权利要求28的药物组合物，其包含多种载体蛋白。31.权利要求27的药物组合物，其包含多种免疫原性糖缀合物。32.权利要求27的药物组合物，其另外包含一种或多种佐剂。33.引起针对一类或多类细菌的免疫应答的方法，其包括对有此需要的受试者给予治疗有效量的权利要求27的药物组合物。34.治疗或预防有此需要的受试者的细菌感染的方法，其包括对所述受试者给予治疗有效量的权利要求27的药物组合物。全文摘要本发明涉及制备免疫原性糖缀合物(特别是用于在受试者中诱导治疗性免疫应答的药物组合物中使用的免疫原性糖缀合物)的方法。本发明的免疫原性糖缀合物包含一种或多种低聚糖或多糖，该低聚糖或多糖通过活性醛基缀合于一种或多种载体蛋白质。因此，本发明提供了制备以下物质的方法(i)不饱和的微生物的n-酰基衍生物低聚糖或多糖；(ii)不饱和的n-酰基衍生物的新颖的缀合物；以及(iii)糖缀合物组合物，其包含用作一种或多种蛋白质的共价连接体的微生物的不饱和n-酰基衍生物的片段的缀合物分子。本发明另外包含所述免疫原性糖缀合物药物组合物用于预防或治疗感染性疾病的用途。文档编号a61k39/395gk101754773sq200880025103公开日2010年6月23日申请日期2008年6月18日优先权日2007年6月20日发明者a·萨卡,f·米琼申请人:巴克斯特国际有限公司;巴克斯特保健股份有限公司