专利名称：：含有肽聚糖的糖缀合物疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明大体来说涉及用于治疗细菌感染的疫苗。具体地说，本发明提供糖缀合物疫苗，其包含治疗有效量的与载体蛋白结合的荚膜多糖，其中所述荚膜多糖包含一定量的能够增强所述疫苗的性质的肽聚糖，这通过例如荚膜多糖与所述载体蛋白的提高的结合效率或通过所述疫苗的提高的免疫原性证明。
背景技术：
：肽聚糖(pg)是细菌细胞壁独有的杂聚合物并且由n-乙酰胺基葡萄糖(glcnac)与n-乙酰胞壁酸(murnac)的交替单元的聚糖主链组成，其中短链肽连接到所述murnac部分的乳酰基。在大多数细菌种属中，糖通过p-l，4-糖苷键连接，并且所述肽的一般结构是l-丙氨酸-d-谷氨酸-二氨基酸-d-丙氨酸-d-丙氨酸。3位上的双碱性氨基酸(上式中的"二氨基酸")通常是革兰氏阳性球菌中的赖氨酸和革兰氏阳性杆菌和革兰氏阴性细菌中的二氨基庚二酸(dap)。位于不同聚糖链上的氨基酸间的肽交联键使得形成复杂的三维大分子，所述大分子形成细菌细胞壁的不可缺少的一部分。所述聚合性聚糖的牢固布置和与肽的进一步交联一起对于决定细菌细胞形状并且从而维持细菌的物理完整性起重要作用。不同细菌种属间在肽聚糖结构上可能略有变化，大部分变化归属于交联的肽。大量报告阐述了肽聚糖在动物模型中的致病效应。因此，需要将肽聚糖从由细菌细胞壁制备的疫苗中除去。举例来说，simelyte等人，/"/e"/挑m冊.68:3535-40(2000)揭示，革兰氏阳性细菌细胞壁的粗制细胞壁制剂当经腹膜腔内加至大鼠中时可导致慢性关节炎。类似地，li等人m/ecf./mm肌69:5883-91(2001)报导，肽聚糖的关节内注射可导致关节炎样症状。myhre等乂,/n/e"./mm肌72:1311-17(2004)将肽聚糖定性为败血症和器官损伤中的主要致病因子。与其态度类似，mattsson寧乂，/n/e"./mm"打.70:3033-39(2002)声称，肽聚糖是引发细菌性败血病和心内膜炎的主要致病因子，同时激活促凝血系统。这些所报告的肽聚糖害效应使得所属领域的传统研究力量集中在使疫苗和其他医药制剂中的肽聚糖含量降到最低。
发明内容令人吃惊地，本发明的发明者已发现，有利的疫苗性质与在包含与载体蛋白结合的荚膜多糖的糖缀合物疫苗中存在至少最低有效量的肽聚糖有关。这些优点包括，例如，结合效率提高和免疫原性增强，同时不导致不可耐受的毒性。因此，本发明的一方面是提供一种疫苗，其包含(a)治疗有效量的包含至少一种荚膜多糖和载体蛋白的糖缀合物免疫原，其中所述荚膜多糖包含最低有效量的肽聚糖，及(b)用于所述免疫原的医药上可接受的载剂。在一实施例中，所述荚膜多糖包含一定量的能够使所述荚膜多糖与所述载体蛋白的结合效率相对于包含约2%的肽聚糖的荚膜多糖提高例如至少约20%的肽聚糖。在另一实施例中，所述荚膜多糖包含一定量的能够增强所述疫苗的免疫原性的肽聚糖。在再一实施例中，所述荚膜多糖包含至少约5%的肽聚糖。在某些实施例中，所述糖缀合物免疫原包含一或多种由葡萄球菌(&a;^3^ococc附)表达的荚膜多糖，例如由金黄色葡萄球菌(5to/7/i;yzococaw表达的荚膜多糖和/或由表皮葡萄球菌(5te/7/^/oco"w表达的荚膜多糖。举例来说，所述荚膜多糖可为5型荚膜多糖、8型荚膜多糖、336荚膜多糖、ps-1荚膜多糖或其组合。在又一实施例中，所述载体蛋白是来自假单胞菌(尸化wom卵w)的外毒素a、破伤风类毒素、白喉类毒素(diphtheriatoxoid)、oc溶血素或panton-valentine杀白细胞素(pvl)。根据另一方面，本发明提供一种治疗细菌感染的方法，其包括施与包含下列的疫苗(a)治疗有效量的糖缀合物免疫原，其中(i)所述糖缀合物免疫原包含至少一种荚膜多糖和载体蛋白并且(ii)所述荚膜多糖包含最低有效量的肽聚糖，和(b)用于所述免疫原的医药上可接受的载剂。在一实施例中，所述荚膜多糖包含一定量的能够使所述荚膜多糖与所述载体蛋白的结合效率相对于包含约2%的肽聚糖的荚膜多糖提高例如至少约20%的肽聚糖。在另一实施例中，所述荚膜多糖包含一定量的能够增强所述疫苗的免疫原性的肽聚糖。在一实施例中，所述荚膜多糖包含至少约5%的肽聚糖。根据另一方面，本发明提供一种制备包含糖缀合物免疫原的疫苗的方法，所述糖缀合物免疫原由至少一种荚膜多糖和载体蛋白组成，所述方法包括(a)使至少一种荚膜多糖与载体蛋白结合，以形成糖缀合物免疫原，其中所述荚膜多糖包含最低有效量的肽聚糖，及(b)将治疗有效量的所述糖缀合物免疫原与用于所述免疫原的医药上可接受的载剂一起调配。在一实施例中，所述荚膜多糖包含一定量的能够使所述荚膜多糖与所述载体蛋白的结合效率相对于包含约2%的肽聚糖的荚膜多糖提高例如至少约209b的肽聚糖。在另一实施例中，所述荚膜多糖包含一定量的能够增强所述疫苗的免疫原性的肽聚糖。在一实施例中，所述荚膜多糖包含至少约5%的肽聚糖。根据又一方面，本发明提供一种提高荚膜多糖与载体蛋白的结合效率的方法，其包括(i)选择包含一定量的能够有助于提高所述荚膜多糖与载体蛋白结合效率的肽聚糖的荚膜多糖，及(ii)使所述荚膜多糖与载体蛋白结合。在一实施例中，所述荚膜多糖包含一定量的能够使所述荚膜多糖与所述载体蛋白的结合效率相对于包含约2%的肽聚糖的荚膜多糖提高至少约20%的肽聚糖。在另一实施例中，所述荚膜多糖包含至少约5%的肽聚糖。根据另一方面，本发明提供一种增强疫苗的免疫原性的方法。所述方法包括(i)选择包含一定量的有助于增强所述疫苗免疫原性的肽聚糖的荚膜多糖，(ii)使所述荚膜多糖与载体蛋白结合，以形成糖缀合物免疫原，及(iii)制备包含所述糖缀合物免疫原和医药上可接受载剂的疫苗。在一实施例中，所述荚膜多糖包含至少约5%的肽聚糖。图1显示金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖的肽聚糖含量与硫醇化间的相关性。在与载体蛋白结合前，通过氨基酸分析来分析经纯化8型荚膜多糖的肽聚糖浓度。使用ellman分析来测定经还原的衍生化多糖的硫醇化比率。具体实施方式如所述，本发明的发明者已发现，存在至少最低有效量的肽聚糖(pg)可赋予包含与载体蛋白结合的荚膜多糖(cps)的糖缀合物疫苗以优点。本文所用"荚膜多糖"同时包括细胞壁相关的和表面多糖抗原。一方面，与cps相关的pg的存在可通过(例如)增强cps的硫醇化而提高cps与载体蛋白的结合效率。结合效率提高可提供多种优点，包括提高结合反应的效率(即有更大百分比的反应试剂变得结合)，及cps与载体蛋白间的交联更强。交联变强又可提供多种优点，包括更大的、免疫原性更强的且更稳定的糖缀合物免疫原分子。另一方面，伴随cps存在pg可增强糖缀合物疫苗的免疫原性。虽然不欲受任何理论束缚，但本发明的发明者认为，细菌多糖抗原与蛋白质载体的结合可改变抗原，使之成为t细胞依赖性免疫原，从而增强疫苗效力。因此，提高cps与载体蛋白的结合效率可增强疫苗的免疫原性。因此，本发明的疫苗的免疫原性要比具有更低pg含量的现有技术调配物的强。因此，本发明提供包含pg的新颖疫苗调配物以及制备和使用所述疫苗调配物的方法。成分本发明提供一种包含治疗有效量的糖缀合物免疫原和用于所述免疫原的医药上可接受载剂的疫苗，所述糖缀合物免疫原包含至少一种cps和载体蛋白，其中所述cps包含至少最低有效量的pg。虽然不欲受任何理论限制，但认为如本文所述获得的cps包含共价结合到所述cps的pg分子。或者，所述cps分子可经由其他作用力与pg分子紧密结合。微多麟嚴,)如上文所述，本文所用术语"荚膜多糖"同时包括细胞壁相关和表面多糖抗原。根据一实施例，所述cps由葡萄球菌表达，例如金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。例示性金黄色葡萄球菌cps包括5型荚膜多糖、8型荚膜多糖和336型荚膜多糖。例示性表皮葡萄球菌抗原包括ps-1荚膜多糖。本发明的疫苗可包含这些类型cps中的一种或多种。根据本发明也可使用其他cps，例如其他细菌性荚膜多糖细胞壁抗原，这些cps可单独使用或与其他抗原(例如上述葡萄球菌抗原)组合。调査显示，约85-90%的金黄色葡萄球菌分离物为5型或8型cps。接种有同时含5型和8型荚膜多糖抗原的疫苗的正常个体可抵抗85-90%的金黄色葡萄球菌菌株导致的感染。因此，根据本发明一实施例，所述疫苗包含5型和8型cps二者的糖缀合物。虽然金黄色葡萄球菌5型和8型cps的化学组成完全相同，但结构却不同。二者均为由n-乙酰基-甘露糖醛酸(mamnacapp)和n-乙酰基-岩藻糖胺(fucnacp)以1:2的比率构成的聚合物，但它们在这些糖间的糖苷键以及o-乙酰基化的位置和程度方面不同。moreau等人，carbohydr.res.,201(2):285-97(1990);fournierfvz对e"rm/cto&oa,138(5):561-7(1987)。二者在其重复单元中均具有fucnacp并且均具有mannacap，此可用于引入巯基。5型和8型多糖抗原的结构己由moreau等「乂#ca力o/i;ydr.201:285(1990)中及由fournier等人在h/e"./mm.45:87(1984)中阐明并且于下文显示5型—4)-卩-d-man/naca(30ac)-(1—4)-a-l-fuc/nac-(1—3)-p-d-fucpnac-(l—8型—3)-卩-d-manpnaca(40ac)-(1—3)-a-l-fucpnac-(1—3)-p-d-fucpnac-(l—尽管结构类似，但尚未在这两种类型间发现可证明的免疫学交叉反应性。另一可用于本发明疫苗中的金黄色葡萄球菌抗原为在美国专利第5,770,208号和第6,194,161号中阐述的336cps。此带负电荷的抗原包含glcnac和1，5-聚(磷酸核糖醇)组分并且不含o-乙酰基。一例示性336抗原特异性地与以atcc55804存放的金黄色葡萄球菌366型的抗体结合。载有此抗原的金黄色葡萄球菌菌株几乎占在临床上重要的非5型或8型菌株的金黄色葡萄球菌菌株的全部。因此，本发明尤其涵盖分别包含5型、8型和366cps的糖缀合物的疫苗。这样的疫苗可对抗由几乎100%的金黄色葡萄球菌菌株导致的感染。有许多在临床上具有重要性的表皮葡萄球菌菌株。用于治疗或预防由表皮葡萄球菌菌株导致的感染的疫苗可包含一含有在美国专利第5，961，975号和第5,866,140号中揭示的l型抗原的结合物。此抗原也称为ps-1，是可通过包含下列步骤的方法获得的酸性多糖抗原生长使抗atcc55254抗血清凝聚的金黄色葡萄球菌分离菌株(i型分离菌株)的细胞，自所述细胞提取多糖抗原，以产生多糖抗原的粗提取物，纯化此粗提取物以产生含有至少最低有效量的肽聚糖的经纯化抗原，如下文所更详细阐述；将所述经纯化的抗原加到分离柱上并用nacl梯度洗脱；及使用对i型分离菌株具有特异性的抗体识别含有所述多糖抗原的洗脱组分。另一用于本发明疫苗中的葡萄球菌抗原在wo00/56357中阐述。此抗原于oc构造中包含氨基酸和n-乙醯基化己糖胺，不含o-乙醯基且不含己糖。其特异性地与以atcc202176储存的葡萄球菌菌株抗体结合。对所述抗原的氨基酸分析显示存在摩尔比率约为39:25:16:10:7的丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、纈氨酸和苏氨酸。氨基酸构成所述抗原分子的约32重量％。赛條々细菌性荚膜多糖抗原通常是弱免疫原。因此，其通常与载体蛋白结合以增强其免疫原性。根据本发明的适宜载体蛋白包括破伤风类毒素和白喉类毒素以及它们的重组产生的基因去毒变体、葡萄球菌外毒素或类毒素、绿脓假单胞菌(ae"必mo"^外毒素a或其衍生物，包括绿脓假单胞菌外毒素a的重组产生的无毒突变菌株，如于例如fattom等乂,/打/am/zmm.61:1023-32(1993)中阐述，以及适合用作免疫载体的其他蛋白质、肽和病毒样颗粒。其他适用于本发明中的载体蛋白包括金黄色葡萄球菌外毒素，例如溶血素(a毒素)和panton-valentine杀白细胞素。外毒素a是来自绿脓假单胞菌的主要致病因子，参见callahan等人,/n/e"./m/mm.43:1019-26(1984)，并且可产生作为本发明疫苗的副产物的毒素中和抗体。这样，本文所述的包含与外毒素a结合的葡萄球菌cps的疫苗可用于有假单胞菌及葡萄球菌感染风险的患者。也可参见pollack寧yl,/czz"./we比63:276-86(1979)，以及cryz寧乂，iev./"/e".9(suppl5):s644-s649(1987)。此蛋白质的重组无毒形式(repa)通过在酶活性位点缺失553位处的谷氨酸获得。lukac等人，/打/e"./mm肌.56.'w95-站(79ss〗。此缺失使得整个蛋白质不具有酶活性，但仍维持天然毒素的抗原性。因此，在本发明内的疫苗可包含含有repa作为载体蛋白的糖缀合物。,覆麟虔嫌體根据本发明，疫苗可含有由cps构成的糖缀合物免疫原，所述cps与载体蛋白结合并且含有至少最低有效量的pg。pg的"最低有效量"是能够改进所述疫苗的性质的量。在一实施例中，改进的性质表现为提高的结合效率，并且所述"最低有效量"表示足以增进cps与载体蛋白的结合的pg量。在另一实施例中，改进的情况表现为增强的免疫的性，并且所述短语"最低有效量"表示足以增强所述疫苗的免疫原性的pg量。举例来说，所述糖缀合物免疫原可包含含有一定量的pg的cps，所述pg的量能够使所述cps与所述载体蛋白的结合效率相对于包含约2%pg的cps增加例如至少约20%(g卩，结合效率是对照cps的1.20倍)。或者，所述糖缀合物免疫原可包含含有一定量的能够增强所述疫苗免疫原性的pg的cps。当然，所述糖缀合物免疫原可包含含有一定量的能够同时提高结合效率和所述疫苗免疫原性的pg的cps。本文所述短语"结合效率"涉及cps与载体蛋白的结合。结合效率提高可表现为在结合过程期间变得与载体蛋白结合的cps的百分比增大。举例来说，根据本发明，下述结合过程使至少50免的cps分子与载体蛋白结合。或者，结合效率提高可表现为cps与载体蛋白间的交联增强。交联增强通常产生更大的糖缀合物免疫原分子，其通常展示出更强的免疫原性。另外，交联增强通常产生更稳定的糖缀合物免疫原分子。给定cps制剂的结合效率可通过业内熟知的方法测定，包括下文所阐述以及实例中所说明的方法。本文中所用结合效率可通过测量cps的硫醇效率测定，如下文和图l中所说明。因此，本文中提供的pg"最低有效量"的定义包括足以提高cps的硫醇化的pg的量。举例来说，所述糖缀合物免疫原可包含含有一定量的pg的cps，所述pg的量能够使所述cps的硫醇化效率相对于含有约2%pg的cps提高至少约20%(即硫醇化效率是对照cps的1.20倍)。给定疫苗的免疫原性可通过业内熟知的方法测定，包括下文所阐述以及实例中所说明的方法。cps的pg含量可以某些氨基酸的w/w%表示，所述w/w%可通过如下进行的氨基酸分析(aaa)测定将lmg/ml的在水中的经纯化cps试样用气相氢氯酸水解。将重构的主要和次要氨基酸转化成在395nm处发出强荧光的稳定荧光衍生物。通过反相hplc对重悬浮的蛋白质水解物实施分析。借助外部和内部标准定量所述氨基酸。存在于所述多糖溶液中的氨基酸源于(l)pg(ala、glx、gly和lys残基)和(2)残余蛋白质(arg、asx、ile、leu、met、phe、ser、thr、thy、val、his禾npro残基)。有两种氨基酸(cys和trp)未加以定量，因此未报导。与pg和残余蛋白质有关的氨基酸的浓度使用以下公式报导为相对于所述cps的质量百分比(gln/glu) (gly) (ala) (lys)=(pg)〖pg〗xioo-。/。肽聚糖[cps〗h氨基酸)=(肽)，(肽)cps-(pg)/(cps)x100=%rp其中[蛋白质]=通过aaa获得的试样蛋白质浓度(mg/ml)[pg]=计算得到的试样肽聚糖含量(mg/ml)[cps]=已知的试样多糖浓度(mg/ml)(肽)eps=总肽浓度%rp=残余蛋白质(％)在一实施例中，所述cps包含至少约5%pg，例如至少5呢pg，包括至少约7%pg，至少约9%pg和至少约11%pg。其他有效的pg量为至少约13%pg、至少约15%pg、至少约17%pg、至少约19%pg、至少约21%pg、至少约23%pg、至少约25%pg和至少约27%pg。短语"至少约"包括在规定量的以上或以下的1%之内的pg百分比。因此，"至少约5%"包括4-6%pg。短语"至少"包括等于或大于规定量的pg百分比。因此，"至少5%"意指5呢或更多的pg。举例来说，本发明涵盖一种包含糖缀合物免疫原和医药上可接受载剂的疫苗，所述糖缀合物免疫原包含至少一种荚膜多糖和载体蛋白，其中所述荚膜多糖以所述荚膜多糖的重量计包含至少约5%(w/w)肽聚糖，并且其中所述载体蛋白为oc溶血素、panton-valentine杀白细胞素、来自假单胞菌的外毒素a、破伤风类毒素或白喉类毒素。在本发明另一实施例中，所述疫苗包含与例如重组外蛋白a(repa)等无毒载体蛋白结合的两种或更多种临床上重要cps型(例如5型、8型和/或336金黄色葡萄球菌)的糖缀合物。在一个这样的实施例中，至少一种所述cps抗原包含至少最低有效量的pg,例如如上所述测定的至少5呢的pg。在另一这样的实施例中，每一cps抗原包含至少最低有效量的pg,例如5免的pg。在又一实施例中，整个所述糖缀合物包含最低有效量的pg，例如至少59b总的pg含量，这是以全部cps抗原的总重计。选择最低有效量的pg可能需要对由pg导致的毒性与由pg提供的提高的疫苗功效(即提高的结合效率和免疫原性)加以平衡。疫苗领域特有的要求是需要对毒性和功效加以平衡，并且所属领域的技术人员在给定环境下可通过常规实验找出此平衡。毒性可通过上述例如将注意力集中在所报导的pg致病效应上的习知技术来测定。功效同样可根据已知的方法测定，如以下实例中所说明。因此，功效可以免疫原性即诱发抗体产生的能力或以提高的结合效率即增强cps与载体蛋白结合的能力来度量。有效量的pg可提供临床医师将认为在毒理上可耐受但仍有效的糖缀合物疫苗。举例来说，临床医师可能发现本发明疫苗(其包含pg含量介于至少约5%至并且包括至少约27%之间、例如至少约19免的cps)可提供提高的功效(即提高的结合效率和/或免疫性)而不展示出不可接受的毒性作用。方法本发明也提供制备本发明糖缀合物疫苗的方法和使用所述疫苗的方法。本发明具体地阐述提高cps与载体蛋白的结合效率的方法、增强糖缀合物疫苗的免疫原性的方法以及治疗或预防细菌感染的方法。縱cps微毅鄉方叙〃被滩一方面，本发明提供一种制备包含具有至少最低有效量pg的cps的糖缀合物疫苗的方法。所述方法包括使至少一种cps抗原与载体蛋白结合而形成糖缀合物免疫原，其中所述cps抗原包含至少最低有效量的pg。将治疗有效量的所述糖缀合物免疫原与用于所述免疫原的医药上可接受的载剂一起调配以产生所述疫苗。在一实施例中，pg的量能够使结合效率相对于包含2%pg的cps提高(例如)至少约20%。在另一实施例中，pg的量能够提高所述疫苗的免疫原性。在另一实施例中，所述cps包含至少约5%的pg。举例来说，本文阐述一种制备包含糖缀合物免疫原和医药上可接受载剂的疫苗的方法，所述糖缀合物免疫原包含至少一种cps和载体蛋白，其中所述荚膜多糖包含量低有效量的pg，且其中所述载体蛋白是oc溶血素、panton-valentine杀白细胞素、来自假单胞菌的外毒素a、破伤风类毒素或白喉类毒素。在一实施例中，以所述cps的重量计，pg的最低有效量是至少约59fcpg。另一方面，本发明提供一种增强疫苗的免疫原性的方法。所述方法包括，选择具有最低有效量pg的cps以有助于增强所述疫苗的免疫原性，及使所述cps与载体蛋白结合以形成糖缀合物免疫原。将治疗有效量的所述糖缀合物免疫原与用于所述免疫原的医药上可接受的载剂一起调配以产生所述疫苗。在一实施例中，所述cps包含至少约5免的pg。在另一方面，本发明提供一种提高cps与载体蛋白的结合效率的方法。所述方法包括，选择具有最低有效量pg的cps以有助于提高结合效率，及使所述cps与载体蛋白结合。在一实施例中，pg的量能够使结合效率相对于包含2%pg的cps提高例如至少约20%。在另一实施例中，所述cps包含至少约5免pg。适用于这些方法中的经纯化cps(包含pg)可通过以下获得，例如，处理细菌以释放cps，然后纯化所述cps。此方法可包括所述细菌的酶消化(使用，例如溶葡萄球菌素、rnase和/或dnase)和cps的回收(使用，例如，乙醇沉淀、离心和过滤)。另外的纯化步骤可包括透析(例如，以除去痕量的乙醇)、二次酶消化(使用，例如，rnase、dnase禾口/或蛋白酶，例如链霉蛋白酶e(pronasee))和透析，进一步回收cps(使用，例如，乙醇沉淀、离心、透析和过滤)，及色谱方法，例如离子交换色谱和/或大小排除/凝胶过滤色谱。所得经纯化cps的pg含量可在例如酶消化步骤处控制。举例来说，调节用于自细菌释放cps的溶葡萄球菌素的量可影响所述cps的pg含量，较低溶葡萄球菌素浓度通常产生较高pg含量。在一实施例中，所述溶葡萄球菌素浓度在约100pg至约1000)ig溶葡萄球菌素/克细胞团之间(约等于约7至约64单位/克细胞团)。在另一实施例中，使用约225pg溶葡萄球菌素/克细胞团(大致为约16单位/克细胞团)。在可选第二溶葡萄球菌素步骤中可使用类似的溶葡萄球菌素量。在一实施例中，将细菌培养物发酵并离心，以获得细胞团。将溶葡萄球菌素以例如约16单位溶葡萄球菌素/克细胞的浓度添加，以达成上述方法的第一酶消化步骤。在另一实施例中，在纯化过程期间再一次添加溶葡萄球菌素。举例来说，在所述第一回收步骤(乙醇沉淀)后可添加约16单位的溶葡萄球菌素/克细胞团。这些溶葡萄球菌素量仅是举例说明并且可根据目标pg含量加以调节。如上所述，增加溶葡萄球菌素浓度通常将产生较低的pg含量，而降低溶葡萄球菌素浓度通常将产生较高pg含量。pg含量也可通过调节溶葡萄球菌素酶消化的温度控制，其中37。c为最优温度，在20至3(tc间的较低温度可导致酶消化延长。因此，在较低温度下进行溶葡萄球菌素酶消化可产生具有更高pg含量的调配物。所产生的经纯化cps的pg含量也可通过调节在所述(可选)第二酶消化步骤中使用的蛋白酶的量来控制，或通过在所述步骤中不使用蛋白酶来控制。举例来说，通常可根据美国专利第6,194,161号、fattom等人于vaccine13:1288-93(1995)中和fa加m等人于/m/e"./mmim.58:2367-74(1990)中所述方法自细菌分离并纯化cps。然而，为了达成具有至少最低有效量pg的cps，在酶处理步骤期间使用比这些出版物中阐述的要低的溶葡萄球菌素浓度，例如约7至约64单位/克细胞团。另外，根据本发明，可将这些出版物中揭示的链霉蛋白酶(蛋白酶)步骤加以修改或略去，以达成具有至少最低有效量的肽聚糖的cps。可使用二维nmr对经纯化的cps(例如来自金黄色葡萄球菌5型和8型血清型的cps)加以分析来评测pg含量。举例来说，nmr谱分析可指示存在丙氨酸、谷氨酰胺/谷氨酸和赖氨酸，它们是主要的pg氨基酸组分。同样，脱-0-乙酰基化5型和8型cps的nmr谱可证明存在两个未经取代的羟甲基，这与在pg中存在(3-glcnac和(3-murnac残基一致。选择具有至少最低有效量pg的cps用于本发明的方法中。所述经纯化cps的pg含量可使用如上文所述的aaa测定。在分离并纯化cps后，使包含至少最低有效量的pg与载体蛋白结合。在一实施例中，通过业内熟知的方法使所述载体蛋白衍生化以利于结合。所述cps抗原也可通过业内熟知的方法衍生化，以利于结合。举例来说，可用adh、胱胺或pdph来使所述cps抗原上的经活化羧酸根基衍生化，然后可使所述cps抗原与所述载体蛋白结合，所述结合通过以下两种方式达成部分酰胺化的抗原与载体蛋白上的羧酸根基之间由碳化二亚胺介导的反应，或者硫醇化cps抗原与spdp衍生的载体蛋白的二硫化物交换。可使用溴化氰或四氟硼酸l-氰基-4-二甲基氨基吡啶錄来活化所述抗原上的羟基，然后可使用六碳双官能间隔剂己二酸二酰肼(adh)对所述抗原进行衍生化(根据业内习知的技术，按照kohn等人f五5^饥154:209:210(1993)的方法)。在一实施例中，所述cps的衍生化通过包含硫醇化的方法达成。这样的方法可通过用二氨基二硫化物(胱胺)酰胺化cps实现。此反应之所以称为"硫醇化"是因为它引入二硫化物键。所述载体蛋白的酰胺化可使用活化的羧基终端连接剂n-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯并行实施。当将通过用二硫苏糖醇(dtt)还原经硫醇化cps产生的游离硫醇添加到spdp衍生的载体蛋白以替换所述吡啶硫醇并经由所述连接剂在所述cps与所述载体蛋白间形成二硫化物键时，达成结合。通常，所产生的糖缀合物通过过滤回收。所述载体蛋白的spdp衍生化与所述cps的硫醇化的比率可经优化，以便保留所述载体蛋白和所述cps上的抗原决定子，并产生更稳定和/或更具有免疫原性的结合物。也可控制并优化游离硫醇的量，以便所选的取代密度可使经硫醇化cps的交联降到最低并有利于cps-蛋白质结合。举例来说，可以1:1的各反应试剂比率进行初始衍生化反应。所得产物的抗原性可通过用所述产物免疫接种动物并通过常规方法测定免疫原性反应来评价。如果需要，可使用不同的比率的反应试剂来进行另外的衍生化反应，以优化所得产物的性质。如上所述，所述经衍生化的cps抗原可通过l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(edac)连接到任何适宜载体蛋白，例如白喉类毒素(dtd)、来自绿脓假单胞菌的重组外蛋白a(repa)、破伤风类毒素(丁丁(1)、06溶血素、？&111011-valentine杀白细胞素(pvl)或另一适宜的载体蛋白。所得的结合物可通过大小排除色谱法与未结合的cps抗原分离。不论使用哪种方法来使所述cps抗原与所述载体蛋白结合，所述cps抗原与所述载体蛋白的共价连接均会显著增强所述cps抗原的免疫原性。这已通过在小鼠中在第一次和第二次疫苗强化后以诱发的抗所述抗原的抗体水平增加形式观察到。因此，使用本发明的具有至少最低有效量pg的cps可提高所述cps与所述载体蛋白的结合效率并且可增强所述疫苗的免疫原性。可使用ellman分析来评价通过硫醇效率测量的结合效率，即通过测量剩余的游离巯基来测定经还原的衍生化cps的硫醇化比率。举例来说，可通过使经还原的衍生化cps试样或对照与5，5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)在室温下反应5分钟来定量游离巯基。此反应产生混合的二硫化物和2-硝基-5-硫代苯甲酸(tnb)。tnb的浓度可通过在412nm处的吸光率和13,600的摩尔消光系数来定量。结果可以每一多糖(ps)三糖重复单元的游离巯基的摩尔比率形式报导。如图1中所示，包含约5%pg的cps具有是包含约2%pg的cps的至少约1.20倍的硫醇化效率。因此，包含约5%的pg的cps相对于包含2%pg的cps展示出25%的增加的结合效率。本发明的疫苗通常包含用于所述糖缀合物免疫原的医药上可接受的载剂。医药上可接受的载剂是可用作所述糖缀合物的媒剂的材料，因为所述材料在疫苗施用的背景中为惰性或另外在医学上可接受，并且与活性剂相容。除适宜的赋形剂外，医药上可接受的载剂可含有习用的疫苗添加剂，如稀释剂、佐剂和其他免疫刺激剂、抗氧化剂、防腐剂和增溶剂。举例来说，可添加聚山梨醇酯80以使聚集降至最低并且起稳定剂作用，并且可添加缓冲剂来进行ph控制。本文所述的疫苗调配物允许相对容易地并且在不影响组成下添加佐剂。另外，本发明的疫苗可经调配以便包括"储积"组分来增加抗原性材料在施与位点的保持。举例来说，除佐剂(如果使用)夕卜，可添加硫酸葡聚糖或矿物油来提供此储积效应。所述疫苗调配物的免疫原性可通过活体外调理吞噬分析评价。举例来说，由5型和8型repa结合物产生的5型和8型特异性抗体的免疫原性可如下使用白细胞(hl-60前髓细胞性白血病细胞系)、补体、单克隆或多克隆cps特异性抗体和5型或8型细菌评价。在零时和60分钟时，测定细菌的调整吞噬或杀死情况。检测结合5型和8型抗原的经诱发抗体的存在的elisa(酶联免疫吸附分析)与5型和8型二者的调理抗体活性间的高相关性将表明，由所述疫苗诱发的抗体起作用并且所述抗体介导类型特异性调理吞噬。另外或另一选择为，可通过例如下文在实例中所述的动物分析评价免疫原性。在这样的分析中，将在用所述疫苗免疫的动物中诱发的抗体水平与未接种疫苗动物中的抗体水平加以比较。包含糖缀合物免疫原的本发明疫苗的例示性调配物包含一或多种与载体蛋白(例如来自假单胞菌的外毒素a、破伤风类毒素或白喉类毒素)结合的葡萄球菌cps抗原(例如金黄色葡萄球菌5型、金黄色葡萄球菌8型、金黄色葡萄球菌336和表皮葡萄球菌ps-1)。所述cps抗原通常包含至少约5%pg，如上文所述测定，但可包含任何能够提高硫醇化效率和/或免疫原性而不具有不可接受毒性的pg量。举例来说，只要所述pg量未达到不被临床接受的毒性限度，则可使用高于10%、15%或20%的pg百分比。潜，繊潘歸揚滩本发明也提供使用本发明疫苗治疗和/或预防细菌感染的方法。这样的方法包括向有其需要的患者施用包含治疗有效量的糖缀合物免疫原的疫苗，其中(i)所述糖缀合物免疫原包含至少一种荚膜多糖和载体蛋白，及(ii)所述荚膜多糖包含至少最低有效量的pg，如上所述。通常，所述疫苗也包含用于所述免疫原的医药上可接受载剂，如上所述。这些方法的目标患者人群包括感染有细菌致病原(例如金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)或有感染所述细菌致病原的包括人类在内的哺乳动物。所述疫苗可以任何期望剂型施与，包括可经静脉内、肌内或皮下施与人类的剂型。所述疫苗可以单剂量施与，或根据多次给药方案施与。施与可通过任一数量之途径，包括皮下、皮内和静脉内。在一实施例中，使用肌内施与。所属领域的技术人员将认识到，施与途径将根据待治疗的细菌感染和疫苗的成分而变化。本发明的疫苗施与时可使用或不使用佐剂。如果使用佐剂，则佐剂应经选择以便避免由佐剂诱发的毒性。本发明的疫苗可另外包含p-葡聚糖或粒细胞集落刺激因子，尤其如在1999年9月14日提出申请并且在2002年3月12日颁予的美国专利第6,355,625号中所述的p-葡聚糖。本发明疫苗的治疗有效量可通过业内常见方法测定。所属领域的技术人员将认识到，所述量将随疫苗的组成、具体患者的特征、所选施与途径以及所治疗细菌感染的性质而变化。一般性指导原则可见，例如，国际协调会议(internationalconferenceonharmonisation)的出版物和remington'spharmaceuticalsc正nces，第27禾口28间，第484-528页(mackpublishingcompany1990)。典型疫苗剂量介于1|ig-400pg。参照以下实例进一步阐述本发明，所提供的这些实例仅是用于举例说明目的。本发明并不限于所述实例，而是包括自本文所提供教示可明了的所有变化形式。实例实例l:5型荚膜多糖的分离效微/靴麟w'5型cps如下自细菌释放通过以下自金黄色葡萄球菌纯化5型cps:将5型细胞团重悬浮在tris缓冲液中。以16单位/克细胞团的终浓度添加溶葡萄球菌素。在3小时的溶葡萄球菌素消化结束时，以40pg/ml混合物的终浓度添加rnase和dnase，以消化核酸并降低混合物粘度。在连续搅拌下将此混合物在37。c下培养3小时。将所述酶混合物在23,000g下离心1小时并收集上清液。微2萝縦、/^w敏裙为了除去消化后的核酸和其他细胞组分，将脱水醇和cacl2添加到所述上清液中。将所述溶液在4'c下存储6-18小时。将所述25%乙醇-沉淀离心并将粒状沉淀去掉。此后实施另一沉淀，以收集粗cps。添加脱水乙醇和cacl2，并将所述溶液在4'c下存储6-18个小时。将所述75%乙醇-沉淀离心并将上清液去掉。将粒状沉淀重新溶解在水中并过滤。透析乙醇纯化的cps，以除去透析试管中痕量的乙醇。透析所述cps并使用毛细管沉淀检验通过血清型识别测试检测透析物和滞留物中是否存在cps。在所述毛细管沉淀检验中，将细菌试样用蔗糖溶液分解并在室温下培养15分钟，并且将一部分经分解细胞用水稀释并再培养15分钟。将试样离心，将上清液的一等分试样收集到毛细管中，并且将等体积的特异性抗血清收集在第二个试管中。将所述抗血清试管的内容物转移到所述试样试管中并在荧光下观察。将在抗血管/试样界面处存在沉淀记录为阳性结果，将不存在沉淀记录为阴性结果。过滤所测试的滞留物并低压冻干。第二汰艨激餘漸为进一步纯化所述粗5型cps,将所述低压冻干材料溶于ph7.2的0.05mtris和2mmmgs04中。以16单位/克细胞团的终浓度添加溶葡萄球菌素。当在透析试管中时(mwio，ooo)，以100(ig/ml的终浓度添加rnase和dnase。将此混合物在37t:下培养4小时。使用毛细管沉淀检验通过血清型识别测试来检测所述经透析的混合物中是否存在ps。第二汰z;,縦、激微游将脱水醇和cacl2添加到来自所述透析试管的滞留物中并将所述悬浮液在4'c下存储6-18小时并离心l小时。收集上清液并将其与脱水醇和cacl2合并。将此悬浮液在23,000g下离心l小时。将粒状沉淀透析过夜，以除去痕量的乙醇。使用毛细管沉淀检验通过血清型识别测试来检测透析物和滞留物中是否存在cps。将滞留物滤过0.45pm的过滤器并在4匸下存储6-18小时。低压冻干并存储所述试样，直至下一步骤。库f爻凍经谱使试样经受离子交换色谱以进行分离。将所述试样施加到deae柱，并且将柱用60ml/hr的流速冲洗5次。使用分光光度法监测流出物的洗脱组分(00206)。大v、谬餘/凝^^游色谱将低压冻干的cps另外使用大小排除/凝胶过滤色谱利用分子大小纯化。将所述低压冻干材料溶于加入柱上的0.2mnaci中并用同一缓冲液洗脱。收集各洗脱组分并在od2q6处监控。收集洗脱峰，如上所述检测血清型同一性，滤过0.45^im过滤器并低压冻干。s4000hplc大小排除色谱(sec)方法是使用biosep-sec-s4000柱来测定金黄色葡萄球菌荚膜多糖(cps)的分子大小的定性程序。在206nm下监测各多糖试样和标记物并产生分布区报告。多糖试样的分子量以分布系数(kd)表示，其自柱标记物体积和试样洗脱体积、柱空体积(2000kd葡聚糖)和总柱体积(甘氨酰基-l-酪氨酸)计算。实例2:对cpspg含量和蛋白质及核酸污染的评价本实例阐述通过氨基酸分析(aaa)定量肽聚糖氨基酸和残余蛋白质氨基酸以及核酸污染的定量。辦使用氨基酸分析(aaa)来测定金黄色葡萄球菌多糖试样中所含肽聚糖和残余蛋白质的浓度。多糖溶液的aaa通过以下实施，利用气相氢氯酸水解试样(制备成在水中的1mg/ml的经纯化多糖)。将重构的主要和次要氨基酸转化成在395nm处发出强荧光的稳定荧光衍生物。通过反相hplc对重悬浮的蛋白质水解物实施分析。借助外部和内部标准定量所述氨基酸。存在于所述多糖溶液中的氨基酸源于(l)肽聚糖(ala、glx、gly和lys残基)和(2)残余蛋白质(arg、asx、ile、leu、met、phe、ser、thr、thy、val、his和pro残基)。有两种氨基酸(cys和trp)未加以定量，因此未报导。与肽聚糖和残余蛋白质有关的氨基酸的浓度使用以下公式报导为相对于多糖的质量百分比%嚴覆箭—)厨農%肽聚糖=￡￡21x100=[cps][pg3迈g/"ml=glu/gin gy ala lys其中[蛋白质]=通过氨基酸分析获得的试样蛋白质浓度(mg/ml)[pg]=计算的试样肽聚糖浓度(mg/ml)[cps]=已知的试样多糖浓度(1mg/ml)举例来说，包含下列的疫苗调配物[pg]mg/ml=glu/gln gly ala lys[pg]mg/ml=0.0119 0.0208 0.0132 0.0122=0.0581mg/ml[cps]=0.96mg/ml含有6.05%pg(%pg=[pg]/[cps]x100=0.0581/0.96x100=6.05%)。免應余歪^^〖w/w)游^,.'%rp=(肽)cps-(pg)/(cps)x100s(氨基酸)=(肽)cps其中(肽)eps=总肽浓度[rp]=计算的试样残余蛋白质浓度(mg/ml)[ps]=已知的试样多糖浓度(1mg/ml)举例来说，包含下列的疫苗调配物(肽)cps=0.0647mg/ml[pg]=0.0581mg/ml[cps]=0.96mg/ml含有0.68%rp(%[rp]=0.0647-0.0581/0.96=0.68%)淑"v力淑度殺激经纯化cps的残余核酸浓度可通过分光光度分析测定。将试样在260nm处的吸光率与鲱鱼精子dna溶液的吸光率进行比较，后者在50pg/ml下具有1.0au的吸光率。试样中dna的浓度报导为总的5型多糖浓度的百分数(％)。实例3:5型和8型cps疫苗效率如上文实例中所述制备的5型和8型cps经测定具有以下性质:测试5型cps批次l批次28型cps批次l批次2分子大小(kd)0.250.260.430.43通过氨基酸分析得出的残余蛋白质(％)0.0280.210.680.45残余核酸(％)<1<1<1<1肽聚糖含量(％)13.5714.176.055.76通过elisa对cps的定量(pg/ml)9410380102通过elisa测定的在小鼠中的效能(pg/ml)66.593.682.977.8通过响应者获得的在小鼠中的效敬io只小鼠/批)10/10*10/1010/1010/10*70%的小鼠相比对照组在抗体效价方面展示出>4乂的增加如表中所示，将5型和8型cps纯化，测定为包含至少59bpg，并且测定为在小鼠中具有免疫原性。低水平的残余蛋白质使计算的肽聚糖含量具有可信性，因为据证明，实质所有的检测到的氨基酸是由肽聚糖而不是由其他残余蛋白质提供的。下文更详细阐述对小鼠中5型和8型cps效能的评价。金黄色葡萄球菌5型和8型cps疫苗的效能可通过小鼠免疫原性测量。所述疫苗的效能通过测量单个小鼠血清中的抗体反应和通过鉴别在抗体反应方面展示出显著(例如4倍)增强的小鼠的比率来测定。例如，可使用以下程序将6至8周龄雌性小鼠分成两组给药，每组10只小鼠。各组均间隔两周接种2次。第一组接受0.25ng疫苗/用pbs/0.01免聚山梨醇酯80稀释成100)il的剂量。第二组小鼠为阴性对照组并且接受100的pbs/0.01免聚山梨醇酯80。在所述第一次注射前至少48小时自各组选定小鼠中收集疫苗接种前血样。在最后一次免疫接种后一周自所有小鼠收集疫苗接种后血样。通过离心自全血试样分离血清试样。通过定量elisa定量所有血清试样中的抗金黄色葡萄球菌5/8型多糖的抗体。将试样施加到涂有5型或8型cps的微量滴定板并培养，用冲洗溶液(0.01m磷酸盐，0.15m氯化钠，0.1呢v/v聚山梨醇酯20)冲洗，以除去任何未结合的鼠科动物抗体。通过随后与结合至辣根过氧化物酶(hrp)的山羊抗鼠科动物免疫球蛋白(igg)抗体的反应测定仍保持与cps结合的抗体的量。通过与3，3',5,5'-四甲基联苯斷tmb)的终点发色反应测定结合的hrp的水平。所述过氧化物酶活性通过终止溶液(l.om磷酸)猝灭并通过450nm处的吸光率定量。可由此分析获得的效能的一量度是在0.25pg剂量组中在5型和8血清抗体水平上相对于对照组中几何平均抗体水平均显示出4倍增加的小鼠的比率(％)。对于金黄色葡萄球菌疫苗中的每只小鼠，相比对照组的效价倍数增加是其血清抗体水平与对照组中小鼠的几何平均抗体水平的比率。可自此分析获得的效能的另一量度是在0.025pg剂量组中观察到的5型和8型抗体水平的几何平均值(|ig/ml)。实例4:毒理学研究对包含5型和8型荚膜多糖的本发明疫苗进行单剂量急性毒性研究，其中各cps均包含至少5呢pg并且与repa结合，如下所述表1对疫苗和疫苗组分进行的毒理学研究tableseeoriginaldocumentpage18
向三组大鼠(每组10只)以在缓冲液中的低(2.92pg/kg)或高(29pg/kg)调配物剂量施与单剂量的疫苗。将各组中一半的动物在24小时后杀死，剩余的动物在施与测试和对照物后7天杀死。评价测试动物的死亡率、临床体征、体重、临床病理学(血液学和临床化学)、眼观病理学和组织病理学。对于临床体征、体重、临床病理学(血液学和临床化学)、眼观病理学和组织病理学，未观察到治疗相关效应。研究展示，所述疫苗在最大测试剂量29pg/kg(以重量:重量计是人类剂量100pg的20倍)下不诱发毒性症状。微2.-賴懂,急丝毒丝,究(7尸j向11组每组10只的icr小鼠施与单剂量的所述疫苗(25(ig5型和8型cps)、单价5型和8型-repa结合物(25吗)、repa(50pg)、绿脓假单胞菌外毒素a(0.1-0.5jig)或牛血清白蛋白。在施与测试物后，对测试动物进行48小时的观察。测量血清试样的转胺酶肝酶sgot和sgpt。仅外毒素a造成死亡和升高的sgot和sgpt水平。在施与金黄色葡萄球菌cps-repa疫苗或repa(各材料以重量:重量计是100吗人类剂量的约900倍)的组中未记录到异常的临床观察结果、意外死亡或毒性效应。实例5:疫苗调配物制备根据本发明的包含a金黄色葡萄球菌5型和8型cps的糖缀合物疫苗。通常，所述疫苗调配物含有金黄色葡萄球菌5型结合物100jig金黄色葡萄球菌8型结合物100聚山梨醇酯800.1mg氯化钠11.7mg磷酸氢二钠2.23mg磷酸二氢钠0.23mg注射用水1.0ml对经纯化cps的测试证明下列分子大小0.16-0.34kd残余蛋白质<1%通过od测得的核酸含量<1%o-乙酰基含量>55%肽聚糖含量至少约5%硫醇:cps摩尔比0.05-.1权利要求1、一种疫苗，其包含(a)治疗有效量的包含至少一种荚膜多糖和载体蛋白的糖缀合物免疫原，其中所述荚膜多糖以所述荚膜多糖的重量计包含至少约5％(w/w)肽聚糖，及(b)用于所述免疫原的医药上可接受的载剂。2、根据权利要求1所述的疫苗，其中所述糖缀合物免疫原包含由葡萄球菌表达的荚膜多糖。3、根据权利要求2所述的疫苗，其中所述糖缀合物免疫原包含一或多种选自由金黄色葡萄球菌表达的荚膜多糖和表皮葡萄球菌表达的荚膜多糖组成的群组的荚膜多糖，其中至少一种荚膜多糖包含至少约5免(w/w)肽聚糖。4、根据权利要求2所述的疫苗，其中所述荚膜多糖选自由5型荚膜多糖、8型荚膜多糖、336荚膜多糖、ps-l荚膜多糖和其组合组成的群组，其中至少一种荚膜多糖包含至少约5%(w/w)肽聚糖。5、根据权利要求1所述的疫苗，其中所述载体蛋白选自由来自假单胞菌的外毒素a、破伤风类毒素、白喉类毒素、oc溶血素和panton-valentine杀白细胞素组成的群组。6、根据权利要求4所述的疫苗，其中所述荚膜多糖包含5型荚膜多糖和8型荚膜多糖。7、根据权利要求4所述的疫苗，其包含(i)与来自假单胞菌的外毒素a载体蛋白结合的5型荚膜多糖和(ii)与来自假单胞菌的外毒素a载体蛋白结合的8型荚膜多糖。8、根据权利要求4所述的疫苗，其包含336荚膜多糖。9、根据权利要求4所述的疫苗，其包含ps-1荚膜多糖。10、根据权利要求4所述的疫苗，其中所述荚膜多糖包含336荚膜多糖和ps-1荚膜多糖。11、一种治疗细菌感染的方法，其包括施与权利要求l所述的疫苗。12、一种制备疫苗的方法，所述疫苗包含包括至少一种荚膜多糖和载体蛋白的糖缀合物免疫原，所述方法包括(a)使至少一种荚膜多糖与载体蛋白结合，以形成糖缀合物免疫原，其中所述荚膜多糖以所述荚膜多糖的重量计包含至少约5%(w/w)肽聚糖，及(b)将治疗有效量的所述糖缀合物免疫原与用于所述免疫原的医药上可接受的载剂一起调配。13、一种提高荚膜多糖与载体蛋白的结合效率的方法，其包括(i)选择包含一定量的有助于提高所述荚膜多糖与载体蛋白结合效率的肽聚糖的荚膜多糖，及(ii)使所述荚膜多糖与载体蛋白结合。14、根据权利要求13所述的方法，其中所述荚膜多糖包含一定量的能够使所述荚膜多糖与所述载体蛋白的结合效率相对于包含约2%的肽聚糖的荚膜多糖提高至少约20%的肽聚糖。15、根据权利要求13所述的方法，其中所述荚膜多糖以所述荚膜多糖的重量计包含至少约5%(w/w)肽聚糖。16、一种增强疫苗的免疫原性的方法，其包括(i)选择包含一定量的有助于增强所述疫苗免疫原性的肽聚糖的荚膜多糖，(ii)使所述荚膜多糖与载体蛋白结合，以形成糖缀合物免疫原，及(iii)制备包含所述糖缀合物免疫原和医药上可接受载剂的疫苗。17、根据权利要求16所述的方法，其中所述荚膜多糖以所述荚膜多糖的重量计包含至少约5%(w/w)肽聚糖。18、一种疫苗，其包含(a)治疗有效量的包含至少一种荚膜多糖和载体蛋白的糖缀合物免疫原，其中所述荚膜多糖包含一定量的能够使所述荚膜多糖与所述载体蛋白的结合效率相对于包含约2%的肽聚糖的荚膜多糖提高至少约20%的肽聚糖，及(b)用于所述免疫原的医药上可接受的载剂。全文摘要本发明涉及用于治疗细菌感染的疫苗，所述疫苗包含含有至少一种荚膜多糖的糖缀合物免疫原，所述至少一种荚膜多糖与载体蛋白结合，以便所述荚膜多糖含有一定量的能够改进所述疫苗的性质的肽聚糖。文档编号a61k39/39gk101132810sq200580047719公开日2008年2月27日申请日期2005年12月2日优先权日2004年12月14日发明者史蒂夫·富勒,埃德·豪斯克内希特,斯科特·温斯顿,阿里·法汤姆申请人:nabi生物制药公司