一种脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明描述了一种制备脑膜炎多糖结合疫苗的方法，并基于该方法，开发出了脑膜炎球菌多糖结合疫苗。该方法由如下步骤组成：(1)用溴化氰活化脑膜炎球菌多糖，然后用乙二胺衍化溴化氰活化的脑膜炎球菌多糖，最后用结构为琥珀酰亚胺酯-r-马来酰亚胺的试剂衍化多糖；(2)载体蛋白的巯基化；(3)衍化的脑膜炎球菌多糖与巯基化的载体蛋白结合。由于脑膜炎球菌多糖与载体蛋白之间的连接桥较长，降低了载体蛋白对多糖抗原表位的空间屏蔽作用，提高了多糖结合疫苗的免疫原性。
【专利说明】一种脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明提供了一种制备流行性脑膜炎荚膜多糖结合疫苗的结合技术；基于此结合技术，制备出了具有较高免疫原性的脑膜炎荚膜多糖结合疫苗，可用于脑脊髓膜炎等重要疾病的免疫预防，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002]流行性脑膜炎是由脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)引起脑膜发炎的急性呼吸道传染病。脑膜炎奈瑟菌主要经由咳嗽，喷嚏或接吻传播，由鼻咽部侵入血循环，最后局限于脑膜和脊髓膜，形成化脓性脑脊髓膜病变。常见的病征包括发高烧、剧烈头痛、后颈僵硬；也会有嗜睡、呕吐、惧光或皮疹等情况出现。此病可引致脑部受损甚至死亡，遍见于世界各国；全世界每年脑脊髓膜炎病例可达30万到35万，呈散发或大、小流行，以儿童发病率为高，可引起相当高的病死率和致残率，是世界范围的一个严重公共健康问题。
[0003]使用抗生素可以有效治疗流行性脑膜炎。在未使用抗生素以前该病的病死率在70%左右，使用抗生素治疗以来病死率降低至5%~15%，甚至低于5%。然而，由于抗生素的过度使用，细菌的耐药菌株数量和种类迅速增长，这引起了医学界的广泛忧虑，并增加了病人的治疗成本。为了应对不断恶劣化的抗药性病菌对人类的威胁，世界各地的医生开始严格地控制抗生素的使用，同时扩大疫苗的接种范围。因此，研制与开发预防流行性脑膜炎的疫苗具有十分重大的意义。
[0004]荚膜多糖(caps ular polysaccharide)是脑膜炎奈瑟菌主要的抗保护性原成分。已确定主要包括a、b、c、d、x、y、z、e、h、1、k、l、w共13个菌群，其中a、b、c、w135和y群引起约95%的病例。脑膜炎球菌多糖疫苗是由提取脑膜奈瑟菌的荚膜多糖所制成的疫苗。由于荚膜多糖是胸腺非依赖性抗原，为半抗原，具有年龄相关的免疫原性，对成人和较大儿童有保护力，但对2岁以下儿童的免疫效果很差，接种剂不能达到抗体保护水平，且抗体很快消失。因此，世界卫生组织建议脑膜炎多糖疫苗一般不用于2岁以下儿童的常规免疫接种。
[0005]多糖结合疫苗是通过化学方法将多糖抗原与载体蛋白(如白喉crm197蛋白、白喉类毒素、破伤风类毒素)共价结合，抗原类型从胸腺非依赖性抗原转变为胸腺依赖性抗原，为全抗原。多糖结合疫苗能激发2岁以下儿童、老年人和免疫缺陷者体内产生有效的免疫应答，并产生免疫记忆。多糖结合疫苗诱生的保护性抗体主要为igg，比多糖疫苗诱生的igm更有效，且能维持较长时间，具有多糖疫苗不可比拟的优势。多糖结合疫苗能为2岁以下儿童提供长期的保护作用，因此具有十分广阔的应用前景。目前，已有多种多糖蛋白结合疫苗获准上市，如单价、二价和四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗。
[0006]目前常用的制备脑膜炎球菌多糖结合疫苗的方法是通过己二酸二酰肼(adh)的化学偶联。该方法首先需要用溴化氰活化多糖，即在碱性条件下用溴化氰作用于多糖分子上的羟基，形成氰酸酯，然后与adh反应；氰酸酯中的一个碳氧键断裂，与adh —端的氨基发生加成反应，从而将酯酰肼(ah)基团导入多糖分子，形成多糖-ah衍生物；多糖-ah衍生物在碳二亚胺(edac)的介导下与载体蛋白形成稳定的结合物。这样的结合方式可提高多糖本身的溶解性，减少多糖与抗血清反应的副作用。然而，上述的多糖-蛋白结合技术存在着以下不足之处=(i)edac在介导adh衍化多糖与载体蛋白结合的同时，容易引起载体蛋白的自身交联，形成载体蛋白的聚合物，从而降低多糖-蛋白的结合效率；(2)多糖和载体蛋白均为大分子，中间靠仅有6个碳原子长度的adh相连，载体蛋白势必会屏蔽多糖的一些重要抗原表位，进而降低多糖的免疫原性。因此，多糖-蛋白结合疫苗的免疫原性有待进一步提高。这些不足之处限制了多糖结合疫苗的进一步发展。
[0007]本发明提出用异型双功能试剂连接衍化的多糖和巯基化的载体蛋白，避免载体蛋白的自身交联，提高多糖-蛋白的结合效率；以长连接桥结合多糖和载体蛋白，降低载体蛋白对多糖重要抗原表位的空间屏蔽作用。本发明提出的多糖-蛋白结合工艺，不仅显著地增加了结合疫苗的产率,而且还大大地增强了结合疫苗的免疫原性。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一种制备脑膜炎多糖结合疫苗的方法，并依据该方法，制备出了脑膜炎球菌多糖结合疫苗。
[0009]本发明的脑膜炎多糖结合疫苗，其中的脑膜炎球菌多糖为血清型为a、b、c、w135和y群的脑膜炎球菌荚膜多糖。
[0010]本发明所涉及的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，其所用的载体蛋白为破伤风类毒素，也可使用crm197和白喉类毒素等。
[0011]本发明所涉及的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，其制备方法由如下步骤组成:
(i)用溴化氰活化脑膜炎球菌多糖，然后用乙二胺衍化溴化氰活化的脑膜炎球菌多糖，最后用结构为琥珀酰亚胺酯-r-马来酰亚胺的试剂衍化多糖；(2)用2-亚氨基硫烷(2-1minothiolane)将载体蛋白的氨基基团转化为巯基；(3)衍化的脑膜炎球菌多糖与巯基化的载体蛋白结合。(4)通过凝胶过滤分离纯化的方法，将结合物与未结合的载体蛋白分开，优选superdex200凝胶过滤柱对结合物进行分离纯化。
[0012]本发明所涉及的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，可用于免疫2个月以上各年龄段的儿童，预防儿童患a、b、c、w135和y群流行性球菌引起的感染性疾病。其特点是能显著增强脑膜炎球菌多糖抗原的免疫原性，减轻婴幼儿的痛苦和家长的负担，降低免疫接种的成本。
[0013]本发明以长连接桥结合多糖和载体蛋白，降低载体蛋白对脑膜炎球菌多糖重要抗原表位的空间屏蔽作用，进一步提高脑膜炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1多糖结合疫苗的制备反应示意图。
[0015]图2凝胶过滤法分离纯化a群脑膜炎多糖结合疫苗。用制备型凝胶过滤柱superdex200 (2.6cmx60cm)分离多糖结合疫苗。分离条件:流动相为20mm的磷酸缓冲液(ph7.4)，流速3.0毫升/分钟，检测波长为280纳米。i峰为a群脑膜炎多糖结合疫苗，2峰为未结合的破伤风类毒素。
[0016]图3凝胶过滤法分离纯化c群脑膜炎多糖结合疫苗。用制备型凝胶过滤柱superdex200 (2.6cmx60cm)分离多糖结合疫苗。分离条件:流动相为20mm的磷酸缓冲液(ph7.4)，流速3.0毫升/分钟，检测波长为280纳米。i峰为c群脑膜炎多糖结合疫苗，2峰为未结合的破伤风类毒素。
[0017]图4sds-page分析多糖结合疫苗。第i泳道是标准蛋白，第2泳道是破伤风类毒素，第3泳道是a群脑膜炎多糖结合疫苗，第4泳道是c群脑膜炎多糖结合疫苗。
[0018]图5多糖结合疫苗产生的多糖特异性抗体。图a为多糖特异性的igg抗体滴度；图b为多糖特异性的iggl抗体滴度。i号样品为a群脑膜炎多糖，2号样品为a群脑膜炎多糖结合疫苗，3号样品为c群脑膜炎多糖，4号样品为c群脑膜炎多糖结合疫苗。
[0019]图6多糖结合疫苗产生的多糖特异性抗体的特异性。()为a群脑膜炎多糖结合疫苗；()为c群脑膜炎多糖结合疫苗。
【具体实施方式】:
[0020]以下通过实施例进一步说明本发明。
[0021]实施例1:a群脑膜炎多糖结合疫苗的制备和分离纯化
[0022](i)a群脑膜炎多糖的活化与衍化
[0023]a群脑膜炎多糖结合疫苗的制备反应如图1所示。将16毫克a群脑膜炎球菌荚膜多糖溶于4毫升生理盐水中，用0.2m naoh调节ph值至10.8。加入32微升50% (w/v)溴化氰溶液进行活化，于室温下反应i小时。在活化的过程中随着ph的不断降低，用0.2mnaoh维持溶液的ph值为10.8。活化结束后，用0.5m的盐酸调节溶液的ph值至8.5，加入i毫升浓度为32毫克/毫升的乙二胺溶液。溶液的ph值降低至5.0左右，随后用0.2m naoh调节溶液的ph值为8.0，于室温下反应过夜。反应结束后，用截留分子量为iookda膜包超滤(赛多利斯公司)换液，超滤溶液为20mm磷酸缓冲液(ph7.4)，超滤体积为3升，除去未反应的溴化氰和乙二胺。
[0024]收集超滤后的活化多糖，与i毫升浓度为12毫克/毫升的6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(emcs)混合，引入马来酰亚胺基团，于4°c下反应过夜。反应结束后，用截留分子量为iookda膜包超滤换液，超滤溶液为20mm磷酸缓冲液(ph7.4)，超滤体积为3升，除去未反应的emcs。收集衍化的多糖。
[0025](2)载体蛋白的衍化
[0026]将破伤风类毒素(tt)与2-亚氨基硫烷以摩尔比1:40混合，反应ph值为7.4，于4°c下反应过夜，2-亚氨基硫烷可将破tt的氨基转化成巯基。反应结束后，用截留分子量为iookda膜包超滤换液，超滤溶液为20mm磷酸缓冲液(ph7.4)，超滤体积为3升，除去未反应的2-亚氨基硫烷。收集衍化的tt。
[0027](3)衍化多糖与衍化蛋白的结合
[0028]巯基化的破伤风类毒素与马来酰亚胺化的a群脑膜炎多糖反应。巯基化的破伤风类毒素与马来酰亚胺化的a群脑膜炎多糖以质量比为1:1的比例混合，反应ph值为7.4，于4°c下反应24小时，得到多糖结合疫苗。
[0029](4)结合物的分离纯化
[0030]a群脑膜炎多糖-蛋白结合物用superdex200凝胶过滤柱(2.6cmx60cm)进行分离纯化，洗脱液为20mm的磷酸缓冲液(ph7.4)，流速为3毫升/分钟。用280纳米检测柱子的流出液。如图2所示，经缓冲液洗脱后出现2个洗脱峰。其中，i峰对应于结合物，为主要的洗脱峰；2峰对应于未结合的破伤风类毒素，为次洗脱峰。这表明破伤风类毒素结合多糖以后，分子量显著增加，出峰时间提前。收集i峰。
[0031]实施例2:c群脑膜炎多糖结合疫苗的制备和分离纯化
[0032](i)c群脑膜炎多糖的活化与衍化
[0033]c群脑膜炎多糖结合疫苗的制备反应如图1所示。将16毫克c群脑膜炎球菌荚膜多糖溶于4毫升生理盐水中，用0.2m naoh调节ph值至10.8。加入32微升50% (w/v)溴化氰溶液进行活化，于室温下反应i小时。在活化的过程中随着ph的不断降低，用0.2mnaoh维持溶液的ph值为10.8。活化结束后，用0.5m的盐酸调节溶液的ph值至8.5，加入i毫升浓度为48毫克/毫升的乙二胺溶液。溶液的ph值降低至5.0左右，随后用0.2m naoh调节溶液的ph值为8.0，于室温下反应过夜。反应结束后，用截留分子量为iookda膜包超滤(赛多利斯公司)换液，超滤溶液为20mm磷酸缓冲液(ph7.4)，超滤体积为4升，除去未反应的溴化氰和乙二胺。
[0034]收集超滤后的活化多糖，与i毫升浓度为16毫克/毫升的emcs混合，于4°c下反应过夜。反应结束后，用截留分子量为iookda膜包超滤换液,超滤溶液为20mm磷酸缓冲液(ph7.4)，超滤体积为3升，除去未反应的emcs。收集衍化的多糖。
[0035](2)载体蛋白的衍化
[0036]将破伤风类毒素(tt)与2-亚氨基硫烷以摩尔比1:40混合，反应ph值为7.4，于4°c下反应过夜。反应结 束后，用截留分子量为iookda膜包超滤换液，超滤溶液为20mm磷酸缓冲液(ph7.4)，超滤体积为3升，除去未反应的2-亚氨基硫烷。收集衍化的tt。
[0037](3)衍化多糖与衍化蛋白的结合
[0038]巯基化的破伤风类毒素与马来酰亚胺化的c群脑膜炎多糖反应。巯基化的破伤风类毒素与马来酰亚胺化的c群脑膜炎多糖以质量比为1:1的比例混合，反应ph值为7.4，于4°c下反应24小时，得到多糖结合疫苗。
[0039](4)结合物的分离纯化
[0040]c群脑膜炎多糖-蛋白结合物用superdex200凝胶过滤柱(2.6cmx60cm)进行分离纯化，洗脱液为20mm的磷酸缓冲液(ph7.4)，流速为3毫升/分钟。用280纳米检测柱子的流出液。如图3所示，经缓冲液洗脱后出现2个洗脱峰。其中，i峰对应于结合物，为主要的洗脱峰；2峰对应于未结合的破伤风类毒素，为次洗脱峰。这表明破伤风类毒素结合多糖以后，分子量显著增加，出峰时间提前。收集i峰。
[0041]实施例3 =sd-page电泳鉴定多糖结合疫苗
[0042]用sds-page电泳鉴定a群和c群多糖结合疫苗。如图4所示，破伤风类毒素在sds-page电泳图上均表现出2条主要的电泳带(第2泳道)。a群多糖结合疫苗(第3泳道)和c群多糖结合疫苗(第4泳道)也表现出2条主要的电泳带，但其迁移速率明显要慢于破伤风类毒素对应的电泳带。这表明a群和c群多糖结合疫苗具有很高的分子量，且要显著大于破伤风类毒素。
[0043]实施例4:多糖结合疫苗免疫原性的测定
[0044]选取24只5周龄的雌性blab/c小鼠，体重为15_22克。随机分为4组，即a群脑膜炎多糖组、c群脑膜炎多糖组、a群多糖结合疫苗组和c群多糖结合疫苗组，每组6只小鼠。腹腔注射，每只每次注射含有5微克多糖的样品，每周注射i次，共注射3次。21天后眼眶取血。用elisa法检测小鼠血浆中抗荚膜多糖的免疫球蛋白(igg)和iggl。[0045]如图5a所示，a群脑膜炎多糖组和c群脑膜炎多糖组产生的抗多糖的igg滴度较弱。多糖与载体蛋白偶联后igg滴度显著增加。与a群脑膜炎多糖组相比，a群多糖结合疫苗组抗荚膜多糖的igg滴度增加了 25.0倍；与c群脑膜炎多糖组相比，c群多糖结合疫苗组抗荚膜多糖的igg滴度增加了 38.3倍。这表明多糖结合疫苗能诱导产生较高的抗体滴度。
[0046]如图5b所示，a群脑膜炎多糖组和c群脑膜炎多糖组产生的抗多糖的iggl滴度较弱。多糖与载体蛋白偶联后iggl滴度显著增加。而且，多糖结合疫苗的iggl滴度接近其对应的igg滴度。与a群脑膜炎多糖组相比，a群多糖结合疫苗组抗荚膜多糖的igg滴度增加了 23.7倍；与c群脑膜炎多糖组相比，c群多糖结合疫苗组抗荚膜多糖的igg滴度增加了 35.7倍。这表明多糖结合疫苗诱导产生igg的亚型主要为iggl。
[0047]实施例5:多糖特异性抗体的特异性
[0048]将接种a群多糖结合疫苗组和c群多糖结合疫苗的小鼠血浆稀释200倍。向2种稀释的小鼠血浆分别加入a群脑膜炎多糖和c群脑膜炎多糖，用elisa方法检测小鼠血浆中抗多糖的抗体水平。如图6所示，随着多糖加入量的增加，多糖特异性抗体结合96孔板中包被多糖的能力逐渐降低。当加入的多糖达到15微克时,抗体结合多糖的能力丧失。这表明小鼠产生的抗多糖抗体能`够特异性地结合多糖。
【权利要求】
1.一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗，以共价键的方式将脑膜炎荚膜多糖连接到载体蛋白上。
2.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，其特征在于所用的脑膜炎荚膜多糖为a群、b群、c群、w135群和y群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖。
3.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，其特征在于所用的载体蛋白包括但不限于破伤风类毒素、crm197和白喉类毒素。
4.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，由以下三步组成:(i)脑膜炎球菌多糖的活化反应与衍化反应；(2)载体蛋白的巯基化；(3)衍化的脑膜炎球菌多糖与巯基化的载体蛋白结合。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述脑膜炎球菌多糖的活化反应与衍化反应中，用溴化氰活化脑膜炎球菌多糖，然后用乙二胺衍化溴化氰活化的脑膜炎球菌多糖，最后用试剂衍化多糖，其中该衍化试剂的结构式为:.0 0.r^\ i?
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述衍化试剂中的r基团为脂肪链和芳香环，其中，优选的r基团为戊基。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于载体蛋白的巯基化，需要用巯基化试剂能将载体蛋白的氨基转化为巯基，所用的巯基化试剂包括但不限于2-亚氨基硫烷(2-1minothiolane)。
8.如权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗制剂是注射剂型。
9.如权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，用于预防脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌的感染。
【文档编号】a61k39/385gk103690944sq201310741474
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】胡涛, 季韶洋, 苏志国 申请人:中国科学院过程工程研究所