专利名称：：肺炎球菌溶血素的结合部分的制作方法
技术领域：
：本发明涉及包含至少一可特异性地结合到肺炎球菌溶血素(pneumolysin)的结合区的结合部分(bindingmember)，特别地涉及包含至少两个结合区的结合部分，以及所述结合部分在诊断和治疗的方法上的应用。另外，还描述了肺炎球菌溶血素肽和包含肺炎球菌溶血素肽的疫苗组合物。
背景技术：
：肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae，sp)是致命细菌感染的头号杀手之一。在发展中国家，每年约有七百万5岁以下的儿童死于肺炎链球菌(匿名的，1985)。在工业化世界，每100,000个人中有5-10例的肺炎链球菌发生，死亡率为5-7％。肺炎链球菌脑膜炎在100,000个人中有1-2例，死亡率为30-40％(leeetal.，1997)。肺炎链球菌还是导致菌血症(bacteremia)的最常见的原因。肺炎链球菌是从患中耳炎的儿童中分离出的最为常见的有机体。大约有75％的低于6岁的儿童会出现中耳炎肺炎链球菌是以成对或短链生长的格兰氏阳性细菌(gram-positivebacterium)。其表面由三层组成荚膜(capsule)、细胞壁(cellwall)和质膜(plasmamembrane)。荚膜是最厚的一层，其完全将生长的肺炎链球菌的内部结构隐藏起来。荚膜主要由具有寡糖(多聚糖)重复单元的聚合物构成。不同的血清型(serotype)含有核醣醇(ribitol)、arabitinol或磷酸胆碱(phosphorylcholine)作为其荚膜部分，因此就出现了对血清型特异性的化学结构。细胞壁除了由肽聚糖(peptidoglycan)构成外，还含有磷壁酸(teichoicacid)和脂磷壁酸(lipoteichoicacid)。质膜为双层磷脂膜(phospholipidmembrane)，其包覆着细胞且将各种分子固定于其表面(alonsodevelasco，1995)。基于肺炎链球菌荚膜的多样性，目前已找到90种不同类型的肺炎链球菌(sorensen，1995)。在肺炎链球菌感染的发病机制中，荚膜是关键。对某一种荚膜类型起作用的抗体能够提供免于感染的保护作用，但对另一种荚膜类型却不起作用。目前的23-价多聚糖疫苗提供对应于至少60-85％的最常见的血清型的保护。肺炎球菌溶血素是某些格兰氏阳性细菌的主要毒性因子，属于胆固醇结合毒素(cholesterol-bindingtoxins)家族中的一员(delostoyosetal.，1996)。其是水溶性蛋白，通过形成环形的低聚物(孔蛋白，porins)而破坏含胆固醇的细胞膜(bonevetal.，2001)。另外，肺炎球菌溶血素通过与fc和补体蛋白的相互作用，以非特异性的方式激活补体系统(complementsystem)。肺炎球菌溶血素的毒性可通过肺炎球菌溶血素基因的位点定向诱变(site-directedmutagenesis)(色氨酸-433到苯基丙氨酸取代)而得以削弱，并产生肺炎球菌溶血类毒素(pneumolysoid，pdb)的表达。(alexanderetal.，1994)。肺炎球菌溶血素在测试的肺炎链球菌菌株中表现为保守的(patonetal.，1983)。基于源自不同肺炎链球菌菌株的肺炎球菌溶血素基因而导出的氨基酸序列中有超过99％的是等同的(mitchelletal.，1990)。可探测的肺炎球菌溶血素抗体iga在儿童的唾液中为(242of261)，在成人中为(17of17)(simelletal.，2001)。肺炎球菌溶血素抗体igg可通过eia而探测出，在大多数两岁以下儿童中为(803of1108)，在成人中为(325/325)(rapolaetal.，2000)。血清转化(seroconversion)与载体状况相关，即曾经感染过由鼻咽的或中耳样品培养的肺炎链球菌的儿童更容易呈肺炎球菌溶血素抗体igg阳性。在使用elisa方法进行的另一独立研究中，在40个健康成人中有7名检测出有igg，其中，32名患者中的17人患有慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，copd)，31名患者中的13人患有球菌肺炎(pneumococcalpneumonia)(musheretal.，2001)。有趣的是，与患有肺炎但没有菌血症的病人相比，只有很少的同时患有肺炎和菌血症的病人中检测出了igg(4/16对9/15)。这表明肺炎球菌溶血素抗体可能防止肺炎进一步发展为菌血症。
发明内容本发明涉及抗溶血(anti-haemolytic)结合部分，其包含至少一可特异性地结合到肺炎球菌溶血素的结合区，其中，结合部分适合用于预防和治疗与链球菌(streptococcus)，特别是肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)相关的疾病和病症的药物组合物中。因此，在一实施方式中，本发明是关于包含至少一可特异性地结合到肺炎球菌溶血素的结合区的分离的结合部分，所述结合区具有对肺炎球菌溶血素的离解常数kd小于1×10-6。优选的是，结合部分包含的的结合区具有如上定义的kd。由于具有高的结合强度，上述结合部分适合用作药物组合物。另外，具有抗溶血(anti-haemolytic)活性的结合部分尤其有用。本发明的另一方面涉及分离的结合部分，其包含至少一第一结合区和第二结合区，所述第一结合区能够特异性地结合肺炎球菌溶血素。根据本发明的结合部分优选为抗体或抗体片段。抗体可通过本领域技术人员熟知的任何适当的方法生产，然而优选的是结合部分的至少一部分是通过重组方法获得。因此，本发明的一方面涉及编码前述定义的结合部分的至少一部分的分离的核酸分子，包含如前所述核酸分子的载体，以及包含前述定义的核酸分子的宿主细胞。本发明还涉及经改造而表达如上定义的结合部分的至少一部分的细胞系，以及更优选为经改造而表达如上定义的整个结合部分的细胞系。在另一方面，本发明涉及探测或诊断个体中与肺炎球菌相关的疾病或病症的方法，该方法包括-从所述个体中提供生物样品；-向所述生物样品中加入如上定义的至少一结合部分；-探测结合到所述生物样品上的结合部分，从而探测或诊断疾病或病症。在该方法中，本发明还进一步涉及包含至少一如上定义的结合部分的试剂盒，其中所述结合部分标记为供诊断方法中使用。本发明的再一方面涉及含有至少一如上定义的结合部分的药物组合物。另外，本发明还涉及如上定义的结合部分在制备治疗或预防与肺炎链球菌，例如肺炎、脑膜炎和/或脓毒症相关的疾病或病症的药物组合物中的应用。本发明的又一方面涉及通过施用有效量的如上定义的结合部分，治疗或预防患有与肺炎链球菌，例如肺炎、脑膜炎和/或脓毒症相关的疾病或病症的个体的方法。其他的方面涉及由抗溶血结合部分识别的肺炎球菌溶血素肽，以及含有该肽的疫苗组合物。图1.fab片段的示意图。图2.具有seqidno11的肺炎球菌溶血素氨基酸序列。图3.抗肺炎球菌溶血素轻链和重链可变片段。图4.接种了肺炎球菌和抗体的小鼠的生存图。图5.肺炎球菌溶血素抗体的抗溶血活性。图6.表位定位(epitopemapping)用肽。图7.确定肺炎球菌溶血素抗体表位的图示说明。图8.26-5f12克隆的分离。图9.26-23c2克隆的分离。图10.221c11克隆的分离。图11.26-5f12，26-23c2和22-1c11的cdr序列。序列seqidno1肺炎球菌溶血素的氨基酸425-436seqidno2肺炎球菌溶血素的氨基酸423-438seqidno3可变轻链26-5f12.1seqidno4可变重链26-5f12.1seqidno5cdr1轻链26-5f12.1seqidno6cdr2轻链26-5f12.1seqidno7cdr3轻链26-5f12.1seqidno8cdr1重链26-5f12.1seqidno9cdr2重链26-5f12.1seqidno10cdr3重链26-5f12.1和26-23c2.2seqidno11肺炎球菌溶血素序列seqidno12可变轻链26-23c2.2seqidno13可变重链26-23c2.2seqidno14cdr1轻链26-23c2.2seqidno15cdr2轻链26-23c2.2seqidno16cdr3轻链26-23c2.2seqidno17cdr1重链26-23c2.2seqidno18cdr2重链26-23c2.2seqidno19可变轻链22-1c11seqidno20可变重链221c11seqidno21cdr1轻链22-1c11seqidno22cdr2轻链22-1c11seqidno23cdr3轻链22-1c11seqidno24cdr1重链22-1c11seqidno25cdr2重链22-1c11seqidno26cdr3重链22-1c11发明的详细描述定义亲合力(affinity)受体和其配体，如抗体和其抗原之间的结合的强度。结合力(avidity)抗体和其抗原的功能性结合强度(functionalcombiningstrength)，其与表位(epitopes)和抗体表位(paratopes)间反应的亲合力以及抗体和抗原的效价有关。氨基酸残基经化学消化(水解)多肽的肽连接部分而形成的氨基酸。在此描述的氨基酸残基优选为“l”同型。但是，只要期望的性能由多肽保留，以“d”异构型存在的残基可取代任何l-氨基酸残基。nh2指存在于多肽的氨基端上的自由的氨基基团。cooh指存在于多肽的羧基端的自由的羧基。为了符合标准的多肽命名，以下对照表中示出了氨基酸残基的简称应当注意的是，在此用符号表示的所有的氨基酸残基序列均采用传统的从氨基端到羧基端的从左到右的顺序。并且，术语“氨基酸残基”被较宽地定义为包含列在对照表中的氨基酸，以及变性的和非天然氨基酸。另外，还应当注意，在氨基酸残基的开头或结尾处的破折号表示连接到后续的一个或多个氨基酸残基的肽键，或连接到氨基酸端例如nh2或乙酰基，或是连接到羧基端例如cooh的共价键。抗体以不同文法形式表达的术语“抗体”在此用于指本发明的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗体结合部位或抗体表位的分子。代表性的抗体分子为完整的免疫球蛋白分子(intactimmunoglobulinmolecules)，基本完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子中的部分，包括那些已知被称为fab，fab′，f(ab′)2和fv的部分。fab的示意图示于图1中。此处所用的术语“抗体”也包括人、单链和人源化抗体，以及这种抗体或其变体，例如具有至少一衍生自抗体分子的抗原结合决定簇的多特异性、双特异性和嵌合分子的结合片段。抗体种类(antibodyclasses)根据免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可被划分到不同的种类中。至少有5种主要的免疫球蛋白的种类iga、igd、ige、igg和igm，并且它们种的某些还能够被继续划分为亚型(同型)，例如，igg-1、igg-2、igg-3和igg-4；iga-1和iga-2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为阿尔法(α)、德尔塔(δ)、厄普西隆(ε)、伽马(γ)和谬(μ)。根据抗体轻链抗体的恒定区的氨基酸序列，轻链可归属到两个有着明显区别的类型之一，其被称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。不同种类的免疫球蛋白的亚单位的结构和三维构想已为人所知。抗体结合部位(antibodycombiningsite)抗体结合部位是特异性与抗原结合(免疫性反应)的抗体分子的结构部分，所述的抗体分子含有重链和轻链可变区和超变区。术语“免疫性反应”以及其各种变形是指含抗原决定簇(antigenicdeterminant)的分子与含抗体结合部位，例如整个抗体分子或其部分之间的特异性结合。抗体结合部位也被称为抗原结合部位(antigenbindingsite)。抗溶血(anti-haemolytic)抑制溶血作用(haemolysis)的能力。这里是通过抑制肺炎球菌溶血素对红血球(erythrocytes)的溶血活性。碱基对(bp)腺嘌呤(a)与胸腺嘧啶(t)，或胞核嘧啶(c)与鸟嘌呤(g)在双链dna分子中的搭配。在rna中，尿嘧啶(u)取代胸腺嘧啶。结合部分(bindingmember)可结合到肺炎链球菌的蛋白上的表位，特别是可特异性地与肺炎球菌溶血素结合的多肽。结合区(bindingdomain)特异性结合到抗原上的抗原结合部位。结合部分可以是多特异性的含有两个或多个结合区，并特异性地结合到两个免疫学性质截然不同的抗原。嵌合抗体(chimericantibody)一抗体，其中可变区源自一种动物种类，恒定区源自另一种动物种类。例如，一嵌合抗体可以是具有源自鼠单克隆抗体的可变区以及人恒定区的抗体。互补碱基(complementarybases)在dna或rna形成双链构象时正常成对的核苷酸。互补决定区(complementaritydeterminingregion)或cdr位于抗体的v-区(可变区)中的区域，与抗体一同形成抗体识别和结合区。互补核苷酸序列(complementarynucleotidesequence)在单链dna或rna分子中顺序排列的核苷酸，其与另一单链上的核苷酸充分互补，并通过随之生成的氢键而特异性地与之杂交。保守的(conserved)如果一核苷酸序列并不与一预选的完全互补的序列进行随意杂交，则该核苷酸序列对于一预选(参考)序列是保守的。保守取代(conservedsubstitution)此处使用的术语“保守取代”是指用生物学上相似的残基取代氨基酸残基。保守取代的例子包括用一憎水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸取代另一憎水残基，或用一极性残基取代另一极性残基，例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酸取代天冬酰胺酸等。只要含有取代的多肽的分子具有相同的功能，则术语“保守取代”也包括使用取代的氨基酸代替未取代的母体氨基酸。恒定区(constantregion)或恒定区(constantdomain)或c-区(c-domain)恒定区是抗体分子中那些包含在可能含有保守取代的给定同型范围内的氨基酸残基序列的结构区域。代表性的重链免疫球蛋白恒定区是免疫球蛋白分子中那些已知为ch1、ch2、ch3、ch4和ch5的部分。代表性的轻链免疫球蛋白恒定区是免疫球蛋白分子中已知为cl的部分。双体分子(diabodies)该术语指具有两个抗原结合部位的小的抗体片段，该片段包含在同一多肽链上连接到轻链可变区(vl)上的重链可变区(vh)(vh-vl)。由于使用的连接太短而不允许同一链上的两区域之间形成配对，该两区域被迫与其他链上的互补区配对，从而产生两个抗原结合部位。双体分子在如下揭示中有更详细的描述例如，ep404,097；wo93/11161；以及hollingeretal.，proc.natl.acadsci.usa906444-6448(1993)。离解常数(dissociationconstant)，kd描述受体和它们的配体，如抗体和其抗原间结合强度(亲合力或结合力)的度量。kd值越小，结合越强。下游(downstream)进一步延dna序列的序列转录或读取方向，即延非编码的dna链的3′-到5′-的方向，或者延rna转录的5′-到3′-的方向。双链dna(duplexdna)含有两条几乎完全互补的多聚核苷酸的双链核酸分子，该双链通过一个或多个位于双链上的互补碱基间形成的氢键结合在一起。由于形成碱基对的核苷酸可以为核糖核苷酸碱基或脱氧核糖核苷酸碱基，术语“双链dna”指dna-dna双链，其包含两条dna链(dsdna)，或rna-dna双链，其包含一条dna链和一条rna链。融合多肽(fusionpolypeptide)是包含至少两个多肽以及一连接序列以将该两个多肽有效连接而成的一个连续多肽。连接在融合多肽中的两个多肽通常衍生自两个不同的肽源，因此，融合多肽含有两个通常以非自然连接方式连接的多肽。fv含有vh和vl的双链抗体片段。基因(gene)核酸，其核苷酸序列编码rna或多肽。基因可以是rna或dna。人源抗体骨架(humanantibodyframework)一分子，其具有抗原结合部位，且该分子的几乎所有其余的免疫球蛋白衍生的部分源是自人免疫球蛋白。人源化抗体骨架(humanisedantibodyframework)一分子，其具有衍生自非人免疫球蛋白的抗原结合部位，其中该分子的一些或所有的其余的免疫球蛋白衍生的部分是源自人的免疫球蛋白。抗原结合部位可包含融合到一个或多个人恒定区上的源自非人免疫球蛋白的的完全的可变区；或移植到可变区中适当的人源化骨架区的一个或多个互补决定区(cdrs)。在人源化抗体中，cdrs可以是来自鼠的单克隆抗体，而抗体的另一区域可以是来自人。杂交(hybridization)通过互补碱基对间氢键的形成，几乎完全互补的核苷酸序列(核酸链)配对而形成双链或异源双链。两互补多聚核苷酸间的作用是特异性的，即非任意性的，且可通过竞争而受到抑制。免疫球蛋白(immunoglobulin)血清抗体，包括igg、igm、iga、ige和igd。免疫球蛋白同型(immunoglobulinisotypes)对具有不同h链的ig的命名，分别为igg(igg1，2，3，4)、igm、iga(iga1，2)、siga、ige、igd。免疫学性质截然不同(immunologicallydistinct)术语“免疫学性质截然不同”是指以抗体的特异性结合到一种多肽而不特异性地结合到另一种多肽上的能力而加以区别两种多肽的能力。个体(individual)活的动物或人，易于患病，特别是易于下述定义的传染性疾病。研究对象(subject)是具有白细胞的有机体，其能够对抗原性刺激和生长因子刺激有反应。在优选的实施方式中，研究对象是哺乳动物，包括人和非人哺乳动物，例如狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔和鼠。在最优选的实施方式中，研究对象是人。传染性疾病(infectiousdisease)由一种或多种链球菌，特别是肺炎链球菌引起的病症。分离的(isolated)用于描述在此揭露的各种结合部分、多肽和核苷酸，它们被识别、分离和/或取自其天然环境中的组分。天然组分中的污染物通常会干扰多肽的诊断或治疗之用，其包括酶、荷尔蒙和其他蛋白质的或非蛋白质的溶质。在优选的实施方式中，多肽经纯化。标记和指示方法(labelandindicatingmeans)尽管以不同的文法形式表达，均指单个原子和分子，其直接或间接地涉及可探测信号的产生以指示复合物的存在。单克隆抗体(monoclonalantibody)以不同文法形式表达的单克隆抗体是指仅含有一种类的抗体结合部位而能与特定的抗原发生免疫反应的抗体分子种群。因此，单克隆抗体通常表现出对任何其可发生免疫反应的抗原的单一结合亲合力。单克隆抗体可含有具有多个抗体结合部位的抗体分子，每一抗体结合部位对不同的抗原呈现出免疫特异性，例如双特异性单克隆抗体。多聚分子(multimeric)含有超过一个多肽的多肽分子。多聚分子可以是含有两个多肽的二聚分子，也可以是含有三个多肽的三聚分子。多聚分子可以是含有两个或多个相同多肽的同聚肽(homomeric)，或者是含有两个或多个不同多肽的异聚肽(heteromeric)。核酸(nucleicacid)核苷酸的聚合物，呈单链或双链。核苷酸(nucleotide)单一单元的dna或rna，包含糖部分(戊糖)、磷酸和含氮的杂环的碱基。碱基通过糖苷碳(戊糖的1′位碳)连接到糖部分，而该碱基和糖的结合即为核苷(nucleoside)。当核苷含有结合到戊糖的3′或5′位碳上的磷酸基团，则被称为核苷酸。有效连接的核苷酸序列在此通常被称为“碱基序列”或“核苷酸序列”以及它们的其他文法等同物，在此所用于表示的化学式从左到右是按照传统的由5′-末端到3′-末端顺序的方向。核苷酸类似物(nucleotideanalog)是嘌呤或嘧啶核苷酸，虽在结构上存在a，t，g，c，或u的差异，但在取代核酸分子上的正常核苷酸的性质上是非常相似的。肺炎球菌(pneumococcus)在使用上与肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)同义。多克隆抗体(polyclonalantibody)多克隆抗体是识别特定抗原的抗体分子的混合物，因此，多克隆抗体可识别所述抗原的不同表位。多聚核苷酸(polynucleotide)单链或双链核苷酸的聚合物。在此使用的“多聚核苷酸”以及其文法等同物包括全部范围内的核酸。多聚核苷酸通常指由两条或多条脱氧核糖核酸和/或核糖核酸的线性链段组成的核酸分子。精确的大小将取决于许多因素，而这些因素又取决于本领域已知的最终使用条件。本发明的多聚核苷酸包括引物、探针、rna/dna片段、寡核苷酸或“益生元(oligos)”(相对较短的多聚核苷酸)、基因、载体、质粒等。多肽(polypeptide)术语“多肽”指含有氨基酸残基的分子，其中在相邻氨基酸残基间仅含有酰胺连接，而不含其他连接。受体(receptor)受体是一分子，例如蛋白、醣蛋白等，其能特异性地(非任意地)结合到另一分子上。重组dna(rdna)分子(recombinantdna(rdna)molecule)通过有效连接两个dna片段而产生的dna分子。因此，重组dna分子是一杂交dna分子，其包含至少两个非天然地连接的核苷酸序列。不具有共同生物起源的rdna，即存在进化上的不同性，被称为“异源的”。特异性(specificity)术语“特异性”指与多肽中给定抗原发生免疫反应(特异性结合)的可能的抗原结合部位的数目。多肽可能为单一的多肽，或通过二硫键结合在一起的多个多肽。多肽可能为单特异性的，含有一个或多个能特异性结合到抗原的抗原结合部位；多肽也可以是双特异性的，含有两个或多个能特异性地结合到两个免疫学性质截然不同的抗原的抗原结合部位。血清型(serotype)对由众多在许多性质上不同的菌株构成的链球菌种类中的细菌的识别。通常用于定义血清型的特征是特定的抗原分子。单链抗体或scfv(singlechainantibody或scfv)术语“单链抗体”指含有一个或多个抗原结合部位的单链多肽。另外，尽管fv片段的h和l链是由不同的基因编码的，它们可直接或通过肽而连接在一起，例如，通过重组的方法，可用合成的衔接物(linker)将h和l链连接成单一蛋白链(称为单链抗体，sab；birdetal.1988science242423-426；andhustonetal.1988pnas855879-5883)。该单链抗体也被包括在术语“抗体”之中，可在设计和制造多特异性结合分子中用作结合决定簇。上游(upstream)与dna转录的方向相反，即延非编码的dna链的5′-到3′-的方向，或者是mrna的3′-到5′-的方向。化合价(valency)术语“化合价”指可能的抗原结合部位，即多肽中结合区域的数目。多肽可以是单价的，仅含一个抗原结合部位，或多肽也可以是双价的，含两个抗原结合部位。此外，多肽可以是四价的，含四个抗原结合部位。每个抗原结合部位特异性地结合一个抗原。当多肽包含多于一个以上的抗原结合部位时，每个抗原结合部位可特异性地与相同或不同的抗原结合。因此，多肽可含有多个抗原结合部位，而为多价的，且多肽可特异性地与相同的或不同的抗原结合。v-区域(v-domain)可变区是包含氨基酸残基序列以形成抗原结合部位的抗体分子中的结构部分。典型的轻链免疫球蛋白的可变区是免疫球蛋白的已知为vl的部分。vl轻链的可变区。vh重链的可变区。载体(vector)为rdna分子，能够在细胞中独立地进行复制，且dna片段，如基因或多聚核苷酸可有效地连接于其上，从而对这些附着片段进行复制。能够引导编码一个或多个多肽的基因的表达的载体在此被称为“表达载体”。特别重要的载体允许使用逆转录酶从mrnas克隆而产生cdna(互补dna)。发明描述如上所述，本发明是涉及结合部分，尤其是能够特异性地识别和结合到肺炎链球菌蛋白、特别是肺炎球菌溶血素的抗体或其片段。根据本发明的结合部分在治疗由肺炎链球菌导致的疾病、以及在应用于探测细菌的诊断方法和试剂盒中均尤为有用。肺炎球菌溶血素优选为具有图2所示的氨基酸序列(seqidno11)的多肽。因此，优选的本发明的结合部分应当是具有免疫活性的，例如，作为抗体时，应当能够结合到抗原上且将该抗原呈现在免疫细胞前，从而有助于对该抗原的吞噬。特别的，结合部分为抗体，其例子包括任何本领域已知的适合的抗体，尤其是在此定义的抗体，例如抗体或抗体的免疫活性片段，或单链抗体。抗体分子是通常具有典型的y-型的分子，其基本单元包括四个多肽，两条相同的重链和两条相同的轻链，它们通过二硫键而共价地结合在一起。这些链中的每一条都折叠在离散的区域。两条重链和轻链的c-末端区域为序列中的保守部分，被称为恒定区，也被称为c-区。n-末端区，也被称为v-区，为序列中的可变部分，对应于抗体特异性。抗体主要通过位于它们的v-区上的六个短的互补决定区(参见图1)来特异性地识别和结合到抗原上。本发明的抗体由于具有对肺炎球菌溶血素的强烈的亲合力而尤为有用。因此，本发明的抗体具有一结合区，其对肺炎球菌溶血素的离解常数kd小于1×10-6m。更优选的是对肺炎球菌溶血素的离解常数kd小于1×10-7m，更优选的是小于1×10-8m，进一步优选的是小于5×10-8m，再进一步优选的是小于1×10-9m，更进一步优选的是小于5×10-9m，还更进一步优选的是小于1×10-10m。对肺炎球菌溶血素的结合部分的亲合力的测量优选按照实施例4中所描述的进行。结合部分优选为如上所定义的分离的结合部分，更优选的是分离的、纯的结合部分。抗溶血活性(anti-haemolyticactivity)另外，具有抗溶血活性的结合部分预期适合于治疗由肺炎链球菌导致的疾病。并不受理论的限制，可以认为抗溶血活性的结合部分对肺炎球菌溶血素的结合防止了肺炎球菌溶血素对靶细胞膜的附着。体外功能化验(assay)优选按实施例2和3所描述那样进行。优选的是，在实施例3所描述的化验中，本发明的结合部分能够在4000ng/ml浓度下抑制至少50％的溶血(haemolysis)。更优选的是，在实施例3所描述的化验中，结合部分能够在4000ng/ml浓度下抑制至少60％，例如80％，85％的溶血，最有优选的为90％的溶血。本发明的最优选的结合部分能够在实施例3所描述的化验中，在160ng/ml浓度下抑制至少50％的溶血(haemolysis)。更优选的是，在实施例3所描述的化验中，结合部分能够在160ng/ml浓度下抑制至少60％，例如80％，85％的溶血，最有优选的为90％的溶血。互补性决定区(complementarity-determiningregions)并不受理论的限制，可以认为高的结合强度和/或抗溶血活性是由于在结合区引入具有一个或多个以下描述的序列中的基序(motif)的氨基酸序列而导致的。在一实施方式中，结合区包含至少一种选自以下组中的氨基酸序列-氨基酸序列seqidno5或其同源物(homologue)，seqidno6或其同源物，以及seqidno7或其同源物，或者-氨基酸序列seqidno14或其同源物，seqidno15或其同源物，以及seqidno16或其同源物，或者优选的，该结合区包含至少一种选自以下组中的氨基酸序列-氨基酸序列seqidno8或其同源物，seqidno9或其同源物，以及seqidno10或其同源物。-氨基酸序列seqidno17或其同源物，seqidno18或其同源物，以及seqidno10。在上述氨基酸序列中，氨基酸序列优选排列在结合区中形成cdr1、cdr2和cdr3，即由其他的氨基酸序列间隔开。更具体的，结合区优选含有一cdr1区，其包含选自seqidno5和seqidno8或它们的同源物的序列，和/或结合区优选含有一cdr2区，其包含选自seqidno6和seqidno9或它们的同源物的序列，和/或结合区优选含有一cdr3区，其包含选自seqidno7和seqidno10或它们的同源物的序列。可选择的，结合区优选含有一cdr1区，其包含选自seqidno14和seqidno17或它们的同源物的序列，和/或结合区优选含有一cdr2区，其包含选自seqidno15和seqidno18或它们的同源物的序列，和/或结合区优选含有一cdr3区，其包含选自seqidno16和seqidno10或它们的同源物的序列。在此描述的申请人的发现表明，可变重链的序列对溶血活性可能是举足轻重的。因此，优选的实施方式包括的结合区含有一个或多个选自以下组中的序列seqidno8，seqidno9，seqidno17，seqidno18和seqidno10或它们的同源物。尤其优选的是结合区含有序列seqidno9或seqidno18，或它们的同源物。更优选的是结合区含有序列seqidno10或它的同源物。因此，特别优选的是结合区的可变部分含有选自seqidno3和seqidno4或它们的同源物的序列，其中的同源物如上文中所定义。可选择的，结合区的可变部分含有选自seqidno12和seqidno13或它们的同源物的序列，其中的同源物如上文中所定义。在优选的具体实施方式中，结合区的可变轻链含有选自seqidno3和seqidno12的序列，或/和最优选的，结合区的可变重链含有选自seqidno4和seqidno13的序列。优选的，任何上述同源物的同源性赋予了含一个或多个同源物的对上述肺炎球菌溶血素的离解常数为kd的结合区。一致性和同源性(identityandhomology)术语“一致性”应当理解为候选序列中与相比较的对应序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，其是在排列序列和引入间隙之后，依据需要而获得整个序列的最大比率的一致性，而不考虑任何保守的取代作为序列一致性的部分。无论n-末端或c-末端的延长或插入皆不应该理解为降低了一致性或同源性。用于排列的方法和计算机程序已为人所知。序列一致性可通过序列分析软件(例如，sequenceanalysissoftwarepackage，geneticscomputergroup，universityofwisconsinbiotechnologycenter，1710universityave.，madison，wis.53705)进行测量。该软件通过各种取代、缺失和其他改性赋予一定程度的同源性而与类似的序列相匹配。在此描述的一个或多个序列的同源物与所定义的序列相比，可能在一个或多个氨基酸上存在不同，但是能够完成相同的功能，即，同源物可被视为预先确定序列的功能性等同物。如上所述，任何预先确定序列的同源物可被定义为i)含有可识别抗原的氨基酸序列的同源物，且该抗原也可被预先确定的氨基酸序列识别，和/或ii)含有可选择性地结合到抗原上的氨基酸序列的同源物，其中，所述抗原也可被预先确定的氨基酸序列选择性地结合，和/或iii)与包含预先确定的序列，如seqidno3，412和13的结合区相比，具有基本上相似的或更高的对肺炎球菌溶血素的结合亲合力的同源物。同源物的例子包括一个或多个保守氨基酸取代，其包括一个或多个在同组预先确定的氨基酸中保守的氨基酸取代，或多个保守氨基酸取代，其中，每个保守取代均是在不同组的预先确定的氨基酸中进行取代而产生。由此，同源物可各自独立地含有保守取代，其中，所述同源物的至少一个甘氨酸被选自由丙胺酸，缬氨酸，亮氨酸，和异亮氨酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代；与之独立的，所述同源物的至少一个所述丙胺酸被选自由甘氨酸，缬氨酸，亮氨酸，和异亮氨酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代；与之独立的，所述同源物的至少一个所述缬氨酸被选自由甘氨酸，丙胺酸，亮氨酸，和异亮氨酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代；与之独立的，所述同源物的至少一个所述亮氨酸被选自由甘氨酸，丙胺酸，缬氨酸，和异亮氨酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代；与之独立的，所述同源物的至少一个所述异亮氨酸被选自由甘氨酸，丙胺酸，缬氨酸，和亮氨酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代；与之独立的，所述同源物的至少一个所述天冬氨酸被选自由谷氨酸，天冬酰胺酸，和谷酰胺组成的氨基酸组中的氨基酸取代；与之独立的，所述同源物的至少一个所述苯基丙氨酸被选自由酪氨酸，色氨酸，组氨酸，脯氨酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代，优选被选自由酪氨酸和色氨酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代；与之独立的，所述同源物的至少一个所述酪氨酸被选自由苯基丙氨酸，色氨酸，组氨酸，脯氨酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代，优选被选自由苯基丙氨酸和色氨酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代；与之独立的，所述同源物的至少一个所述精氨酸被选自由赖氨酸和组氨酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代；与之独立的，所述同源物的至少一个所述赖氨酸被选自由精氨酸和组氨酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代；与之独立的，所述同源物的至少一个所述天冬酰胺酸被选自由天冬氨酸，谷氨酸，和谷酰胺组成的氨基酸组中的氨基酸取代；与之独立的，所述同源物的至少一个所述谷酰胺被选自由天冬氨酸，谷氨酸，和天冬酰胺酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代；与之独立的，所述同源物的至少一个所述脯氨酸被选自由苯基丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，和组氨酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代；与之独立的，所述同源物的至少一个所述半胱氨酸被选自由天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，天冬酰胺酸，谷酰胺，丝氨酸，苏氨酸，和酪氨酸组成的氨基酸组中的氨基酸取代。保守取代可被引入到优选的预先确定的序列中的任意位置。然而，有时也希望引入非保守取代，特别是但不限于在一个或多个位置引入非保守取代。导致在此提及的序列的功能等同的同源物形成的非保守取代的例子如i)在极性上有显著区别的，例如具有非极性侧链(丙胺酸，亮氨酸，脯氨酸，色氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯基丙氨酸或蛋氨酸)的残基取代具有极性侧链(甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺酸或谷酰胺)的残基或带电荷的氨基酸如天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸或赖氨酸，或者用非极性基团取代带电荷的或极性残基；和/或ii)在对多肽骨架取向上有显著不同的影响，例如用其他的残基取代脯氨酸或甘氨酸；和/或iii)在所带电荷上显著不同，例如，用带负电的残基如谷氨酸或天冬氨酸取代带正电的残基如赖氨酸，组氨酸或精氨酸(反之亦然)；和/或iv)在空间体积上有显著区别，例如用大体积的残基如组氨酸，色氨酸，苯基丙氨酸或酪氨酸取代具有微小侧链的残基如丙胺酸，甘氨酸或丝氨酸(反之亦然)。在一实施方式中，氨基酸的取代可基于它们的疏水性和亲水性值以及氨基酸侧链取代基的相对近似性，包括电荷、大小等而进行。考虑了上述各种特性在内的典型的氨基酸取代是那些本领域熟知的取代，包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷酰胺和天冬酰胺酸；缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。在一实施方式中，结合区包含具有与选自seqidno5，6，7，8，9，10，14，15，16，17和18中的序列有至少60％相同的氨基酸序列的同源物。在一优选的实施方式中，结合区包含具有与选自seqidno3，4，12和13中的序列有至少60％相同的氨基酸序列的同源物。更优选的，同源物与选自seqidno5，6，7，8，9，10，14，15，16，17和18中的序列、优选为与选自seqidno3，4，12和13中的序列有至少65％，例如至少70％相同的，如至少75％相同的，如至少80％相同的，如至少85％相同的，如至少90％相同的，如至少95％相同的，如至少98％相同的的序列。在一更为优选的实施方式中，上述提及的百分比率与同选自seqidno3，4，12和13的序列相比较的同源物序列的确认相关。表位(epitopes)本发明的抗溶血结合部分优选识别和结合到表位，该表位同时也被具有含选自seqidno3，4，12或13组的序列的可变部分的抗体识别。在一实施方式中，抗溶血结合部分的结合区识别在肺炎球菌溶血素的n-末端基部分的表位。优选的，对应于肺炎球菌溶血素的氨基酸1-436的n-末端基部分被确定为seqidno11。进一步优选的是，由结合区识别的表位位于氨基酸50-436内，或者，优选的是，肺炎球菌溶血素的氨基酸100-436被确定为seqidno11。在具体的实施方式中，由结合区识别的表位位于肺炎球菌溶血素的氨基酸200-435或300-435内，被确定为seqidno11。本发明的结合部分的结合区优选识别由seqidno27确定的氨基酸序列构成的表位。在优选的实施方式中，结合区识别由seqidnos28，29，30和31构成的表位，更优选为识别由seqid29和30构成的表位。更优选的是，由结合区识别的表位在氨基酸400-438中，优选为由seqidno11确定的肺炎球菌溶血素的氨基酸420-436。在具体实施方式中，由结合区识别的表位在由seqidno11确定的肺炎球菌溶血素的氨基酸422-436或425-436中。血清型(serotypes)如上所述，已经确定肺炎链球菌有90种不同的血清型。优选的是本发明的结合部分能够结合来自两种或更多种不同链球菌血清型的肺炎球菌溶血素，如来自三种或更多种不同链球菌血清型，如来自四种或更多种不同链球菌血清型，如来自五种或更多种不同链球菌血清型。更优选的是本发明的结合部分能够识别和结合来自几乎所有血清型的链球菌。单克隆/多克隆抗体(monoclonal/polyclonalantibodies)在本发明的一实施方式中，结合部分为抗体，其中，所述抗体可为源自哺乳动物的多克隆或单克隆抗体，或为单克隆抗体的混合物。在一优选的实施方式中，结合部分为单克隆抗体或其片段。所述抗体可为任何类型的抗体，但优选的为igg抗体。更为优选的抗体为igg1抗体或其片段。单克隆抗体(mab’s)为那些其中的每个抗体分子均相似且识别相同表位的抗体。通常，单克隆抗体是通过杂种瘤细胞系(hybridomacellline)得到的。制备单克隆抗体和合成抗体的杂种瘤的方法已为本领域技术人员所熟知。产生抗体的杂种瘤可通过如融合产生抗体的b淋巴细胞(antibody-producingblymphocyte)和永生化细胞系(immortalizedcellline)而制备。单克隆抗体可通过以下步骤产生。在各种方法中，给动物免疫接种如上所述抗体，如蛋白(或其肽)，以制备多克隆抗体。免疫接种通常是给免疫活性(immunologicallycompetent)哺乳动物施用免疫有效量的免疫原，即足以产生免疫反应的免疫原。优选的，上述哺乳动物是一啮齿类动物例如为兔、大鼠或小鼠。然后，对哺乳动物进行一段时间的强化免疫期，以产高亲合力的如上所述的抗体分子。从分泌期望抗体的每个免疫接种的哺乳动物中除去产生抗体细胞的悬浮液。在经过足够时间产生高亲合力的抗体后，处死动物(如小鼠)，从一个或多个淋巴结、脾和外周血获得产生抗体的淋巴细胞。脾细胞是优选的，且可采用本领域熟知的方法在生理学介质中机械分离为独立的细胞。产生抗体的细胞通过融合到小鼠的骨髓瘤(myeloma)细胞系而被永生化。小鼠的淋巴细胞产生了高百分比的与小鼠同源的骨髓瘤的稳定融合，然而，也可使用大鼠、兔和青蛙的体壁细胞。产生期望抗体的动物的脾细胞通常在融合剂，如聚乙二醇的存在下，通过与骨髓瘤(myeloma)细胞融合而被永生化。任何一种适合作为融合搭档的骨髓瘤(myeloma)细胞系均可用于标准技术中，例如p3-ns1/1-ag4-1，p3-x63-ag8.653或sp2/o-ag14骨髓瘤(myeloma)系(可由americantypeculturecollection(atcc)，rockville，md获得)。单克隆抗体也可通过其他重组dna
技术领域：
中熟知的方法产生。一种替代的方法，即被称为“组合抗体展示”(″combinatorialantibodydisplay″)的方法，已发展为识别和分离具有特定抗原特异性的抗体片段的方法，该方法可被用于产生单克隆抗体。多克隆抗体为可识别特定抗原的抗体分子的混合物，因此，多克隆抗体能够识别所述抗原内的不同表位。通常，多克隆抗体从哺乳动物的血清中纯化，而该哺乳动物事先用抗原进行过免疫接种。多克隆抗体可由“抗体”(antibodies)中描述的任意方法制备，例如alaboratorymanual，byedharlowanddavidlane，coldspringharborlaboratorypress，1988。多克隆抗体可源自任意适合种类的哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、驴、山羊和绵羊。特异性(specificity)结合部分可以是对肺炎球菌溶血素为单特异性的，其中，对肺炎球菌溶血素的特异性指结合部分与肺炎球菌溶血素进行免疫反应。在另一实施方式中，结合部分是双特异性的或多特异性的，其具有至少一个对肺炎球菌溶血素为特异性的部分。单价抗体(monovalentantibodies)单特异性结合部分可以是单价的，即仅有一个结合区。对于单价抗体，免疫球蛋白恒定区氨基酸残基序列包含了已知为ch1，ch2，ch3和ch4的抗体分子的结构部分。优选的是那些被称作cl的结合部分。优选的cl多肽选自由ck(ckappa)和cλ(clambda)组成的组。另外，既然恒定区可为重链恒定区或轻链恒定区(分别为ch或cl)，根据本发明可构思出大量的单价结合部分组合物。例如，轻链恒定区能够通过二硫键而桥连另一轻链恒定区或一重链恒定区。与之不同的是，重链恒定区能够形成两个独立的二硫键桥，可桥链至另外两个重链及一个轻链，或者形成重链的聚合物。因此，在另一实施方式中，本发明提出了一种组合物，其包含一单价多肽，其中恒定链区c具有半胱氨酸残基，其可形成至少一二硫桥，且该组合物含有至少两个通过所述二硫桥共价连接的单价多肽。在优选的实施方式中，恒定链区c可以是cl或ch。当c是cl时，cl多肽优选自由ck(ckappa)和cλ(clambda)组成的组。在另一实施方式中，本发明提出了一种结合部分组合物，其包含一如上所述的单价多肽，但c是具有可形成二硫桥的半胱氨酸残基的cl，于是该组合物含有两个由所述中恒定链区c具有，其可形成至少一二硫桥，且该组合物含有至少两个通过所述二硫桥共价连接的两个单价多肽。多价的(multivalent)在本发明的另一实施方式中，结合部分为多价的结合部分，其具有至少两个结合区。所述结合区可以对相同配体或不同配体具有特异性。多特异性，包括双特异性(multispecificity，includingbispecificity)在一优选实施方式中，本发明涉及多特异性结合部分，其对至少两个不同存在体有亲合力且能与之结合。多特异性结合部分可包括双特异性结合部分。在一实施方式中，多特异性分子为一双特异性抗体(bsab)，其载有至少两个不同的结合区，其中至少一个为抗体源(antibodyorigin)。本发明的双特异性分子也可以是单链双特异性分子，例如单链双特异性抗体、包含一单链抗体和一结合区的单链双特异性分子、或包含两结合区的单链双特异性分子。多特异性分子也可为单链分子或可包含至少两条单链分子。包括双特异性抗体在内的多特异性抗体可采用本领域熟知的方法生产。传统的产生双特异性全抗体(wholeantibodies)的方法是融合两个分别产生具有期望特异性的抗体的杂种瘤细胞系。由于与免疫球蛋白的重链和轻链的任意缔合(association)，这些杂交的杂种瘤将产生多达10种不同重链和轻链组合的混合物，而其中仅有一种是双特异性抗体。因此，这些双特异性抗体需要通过繁杂的步骤进行纯化，而这就大大地降低了目标产物的产率。替代的方法包括在体外连接两个抗原特异性，即在铰链(hinge)或通过基因引入的上述的c-端基半胱氨酸进行化学交联半胱氨酸残基。通过用促进异源二聚体形成的肽对fab’s的重组融合，获得了对这种体外组装的改进。但是，这些方法中的双特异性产物的产率远远低于100％。在holliger等(1993)中揭露了一种更为有效的不包含体外化学组装步骤的生产二价或双特异性抗体片段的方法。该方法的建立是基于对由细菌分泌的scfv′s通常以单体和二聚体存在的观察结果。该结果表明不同链的vh和vl可成对，从而形成二聚体和更大的复合物。由hollinger等命名为“双体分子”(diabodies)的二聚抗体片段实际上是在体内组装的小的二价抗体片段。通过连接两个不同抗体1和2的vh和vl，形成“交叉”(cross-over)链vh1vl2和vh2-vl1，二聚过程被视为重新组装两个抗原结合部位。两个结合部位的亲合力被视为与起始scfv′s相同，或在共价连接vh和vl的连接多肽被移去后有10倍的增长，因此而产生了两个蛋白，每一个都由一个直接以共价形式连接至未与vh配对的vl上的vh组成。这种产生双特异性抗体片段的策略也在若干专利申请中有揭露。专利申请wo94/09131(scotgenltd；优先权日1992年10月15日)涉及一双特异性蛋白，其中结合区源自存在于两条链上或在scfv中连接在一起的vh和vl区，而其他融合的抗体区，例如c-端恒定区被用于稳定二聚体结构。专利申请wo94/13804(cambridgeantibodytechnology/medicalresearchcouncil；第一优先权日1992年12月4日)涉及一含vh和vl的多肽，其中vh和vl不能够相互缔合，由此v-区在有或没有连接物的情况下均能被连接。mallender和voss，1994(也揭露于专利申请wo94/13806；dowchemicalco；优先权日1992年12月11日)报道了在大肠杆菌(e.coli)中体内生成单链双特异性抗体片段。双价蛋白的双特异性是基于两个先前产生的单价scfv分子，该scfv分子具有截然不同的特异性，且在基因水平上由柔性的连接多肽将它们连接起来。一直以来，当提起单链抗体片段时，就意味着在有或没有连接多肽存在的下，由一条连接至一条(相应)轻链的重链所组成的单个分子。当通过“二聚体”方法(holliger等(1993)，及专利申请wo94/09131)或者通过“双scfv”(doublescfv)法(mallender和voss，1994，以及专利申请wo94/13806)制造双价或双特异性抗体片段时，vh是连接到一个(相应的)vl上的。上述的多特异性分子可通过许多方法制造。例如，可将所有的特异性编码到相同的载体中，再在相同的宿主细胞中进行表达和组装。这种方法在多特异性分子是mabxmab，mabxfab，fabxf(ab′)2或配体xfab融合蛋白时特别有用。各种其他的的用于制备双价或多价抗体的方法描述于u.s.pat.nos.5,260,203；5,455,030；4,881,175；5,132,405；5,091,513；5,476,786；5,013,653；5,258,498；和5,482,858中。比起使用单特异性/单价结合部分，通过使用本发明的双特异性或多特异性结合部分提供了一些优势。双特异性/多特异性结合部分具有第一结合区，其能够特异性地识别和结合链球菌蛋白质，特别是肺炎球菌溶血素，而其他的结合区可用作其他用途在一实施方式中，与第一结合区相比，至少一其他的结合区被用作结合链球菌蛋白，例如结合到同一链球菌蛋白上的其他的表位。由此，对链球菌种的特异性可被增加，且结合部分的结合力也随之增加。在另一实施方式中，至少一其他结合区可被用于特异性地与哺乳动物细胞，例如人细胞结合。优选的是，至少其他结合区能够与免疫活性细胞，如白细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、嗜碱性细胞，和/或嗜曙红细胞结合，以增加结合部分在治疗程序中的效果。这可以通过建立至少一个其他可特异性地与哺乳动物蛋白，如人蛋白中的选自分化群分子蛋白(cd)中的任何一种蛋白，特别是cd64和/或cd89结合的结合区而实现。生成具有cd64特异性的双特异性抗体的方法在medarex，inc的美国专利us6,071,517中有描述。在此用的“效应细胞(effectorcell)”指免疫细胞，其为白细胞或淋巴细胞。特异性效应细胞表达特异性fc受体并实现特异性免疫功能。例如，表达cd89受体的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、和淋巴细胞均涉及特异地杀死目标细胞和向免疫系统的其他成分呈递抗原，或与呈递抗原的细胞结合。人源化抗体骨架(humanisedantibodyframework)在用于人的疗法中使用非人抗体并不总是令人满意的。这是由于非人的“外来”表位可能会在受治疗的个体中启动免疫反应。为了消除或将与非人抗体相关的问题减为最小，最好是对嵌合抗体(chimericantibody)衍生物，即对合并了非人fab可变区结合决定簇和人恒定区(fc)的“人源化”抗体分子进行改造。这种抗体的特征在于具有相当于上述单克隆和多克隆抗体的抗原特异性和亲合力，且在施用于人时产生更小的免疫原性，因此更有可能被受治疗的个体所耐受。因此，在一实施方式中的结合部分具有一载有人源化抗体骨架的结合区，也称为人源化抗体。人源化抗体通常为嵌合抗体，含有源自人抗体的区域和源自非人抗体的区域，例如啮齿动物的抗体。人源化(也称为重构或cdr-移植)是一种成熟的技术，用于减小来自异种源(xenogeneicsources)(通常为啮齿动物)的单克隆抗体(mabs)的免疫原性，以及增加对人免疫球蛋白的同源性，和增强对人免疫系统的活化。因此，人源化抗体通常是用啮齿动物抗体中的同功部位的残基取代人抗体中的某些cdr残基，以及有可能对某些骨架残基进行取代了的人抗体。更为重要的是，人源化抗体保留了对抗原的高度亲合力，以及其他有利的生物学特性。根据一优选的方法，为达到此目标，人源化抗体通过用亲本的和人源化序列的三维模型对亲本(parental)序列和各种概念人源化产品进行分析而制备。三维免疫球蛋白模型通常都能获得且为本领域技术人员所熟悉。也可获得计算机程序，其描述和显示出选出的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些显示结果的检验使得对某些残基在候选免疫球蛋白序列的机能中可能扮演的角色的分析成为可能，也即是使得对影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基的分析成为可能。这样，尽管对抗原结合最为直接和影响最大的是cdr残基，但骨架区残基可从受体中选出并结合，且可引入序列，从而使得所期望的抗体特征，例如对目标抗原亲合力的增加，得到最大化。一种用于人源化单克隆抗体(mabs)的方法与嵌合抗体(chimericantibodies)的生成有关。其中，含有完全抗体可变区的抗体结合部分与源自第二抗体、优选为人抗体的恒定区进行融合。进行这样的嵌合过程的方法描述在ep-a-0120694(celltechlimited)、ep-a-0125023(genentechinc.)、ep-a-0171496(res.dev.corp.japan)、ep-a-0173494(stanforduniversity)和ep-a-0194276(celltechlimited)中。更为复杂的抗体人源化的形式包括对可变区进行重新设计，以使得构成非人抗体结合部位的氨基酸与人抗体可变区骨架整合。(jonesetal.，1986)。本发明的人源化抗体可通过任何能够用源自非人抗体的cdr取代人抗体的至少一部分cdr的方法而制得。winter揭露的方法可被用于制备本发明的人源化抗体(英国专利申请gb2188638a，申请日1987年3月26日)，其中所揭示的内容在此被明确引进作为参考。非人的cdrs可借用如下例子中所描述的寡核苷酸的位点定向诱变而取代人cdrs。例如，本发明的人源化抗体可通过如下描述的简短说明而制造。本发明的人源化抗体可通过以下步骤而制得(a)由传统技术构建一表达载体，其含有一具有编码抗体重链的dna序列的操纵子(operon)，在该重链中，cdrs和可变区骨架区用于保留抗体结合特异性所需要的最小部分是源自非人的免疫球蛋白，而抗体链的剩余部分是源自人免疫球蛋白，由此产生本发明的载体；(b)由传统技术构建一表达载体，其含有一具有编码互补抗体轻链的dna序列的操纵子，在该轻链中，cdrs和可变区骨架区用于保留给体结合特异性所需要的最小部分是源自非人的免疫球蛋白，而抗体链的剩余部分是源自人免疫球蛋白，由此产生本发明的载体；(c)用传统技术将表达载体转染到宿主细胞中，以产生本发明的转染的宿主细胞；并且(d)用传统技术培养转染的细胞，以产生本发明的人源化的抗体。可将本发明的两个载体均转染到宿主细胞中，其中，第一个载体含有编码源自多肽的轻链的操纵子，第二个载体含有编码源自多肽的重链的操纵子。两个载体含有不同的可选择的标记物，然而除了抗体重链和轻链编码序列不同外，两个载体优选是相同的，以尽可能地保证重链和轻链多肽的相同表达。另外，还可以使用单个载体，该载体包括编码轻链和重链多肽的序列。轻链和重链的编码序列可包含cdna或基因组dna或两者均包含。用于表达本发明的改造的抗体的宿主细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌，或真核细胞。特别的是可使用经证实适合该目的的哺乳动物细胞，例如骨髓瘤细胞或中华仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovarycell)。一般用于构建本发明载体的方法、用于产生本发明的宿主细胞的转染方法、以及用于从该宿主细胞产生抗体的培养方法均为传统技术。同样的，在制得抗体后，本发明的人源化抗体可通过如下描述的步骤进行纯化。人抗体骨架(humanantibodyframework)在更为优选的实施方式中，本发明涉及一结合部分，其中的结合区由人抗体骨架携带(carried)，即比起人源化抗体而言，这里的抗体具有更多成分的人肽序列。针对人蛋白的(directedagainsthumanproteins)人单克隆(mab)抗体可通过使用携有完全人免疫系统而非鼠系统的转基因(transgenic)小鼠而获得。取自用感兴趣抗原免疫过的转基因小鼠的脾细胞被用于产生杂种瘤(hybridoma)，以分泌对人蛋白的表位具有特异性亲合力的人单克隆(参见如wood等的国际专利申请wo91/00906；kucherlapati等的pct公开wo91/10741；lonberg等的国际专利申请wo92/03918；kay等的国际专利申请92/03917；lonberg，n.等的1994nature368856-859；green，l.l.等的1994naturegenet.713-21；morrison，s.l.等的1994proc.natl.acad.sci.usa816851-6855；bruggeman等的1993yearimmunol733-40；tuaillon等的1993pnas903720-3724；bruggeman等的1991eurjimmunol211323-1326)。这样的转基因小鼠可由abgenix，inc.，fremont，calif.，medarex，inc.，和annandale，n.j.获得。据报道，嵌合小鼠和生殖系(germline)突变小鼠中抗体重链连接区(joiningregion(ih))基因的纯合性缺失导致了对产生内生抗体的完全抑制。将人生殖系(germline)免疫球蛋白基因排列转移至生殖系(germline)突变小鼠，将会在抗原激发(antigenchallenge)作用下导致人抗体的产生。例如，参见jakobovits等，proc.natl.acad.sci.usa902551(1993)；jakobovits等，nature362255-258(1993)；bruggermann等，yearinimmunol.733(1993)；和duchosal等，nature355258(1992)。人抗体还可衍生自噬菌体库(phage-displaylibraries)。(hoogenboom等，j.mol.biol.227381(1991)；marks等，j.mol.biol.222581-597(1991)；vaughan，等，aturebiotech14309(1996))。片段(fragments)在本发明的一实施方式中，结合部分是抗体片段，优选为抗体的结合片段或可变区。本发明中有用的抗体片段的例子包括fab、fab′、f(ab′)2和fv片段。木瓜蛋白酶对抗体的消化产生两个相同的抗原结合片段，称为fab片段，每个fab具有一单一抗原结合部位。另外，木瓜蛋白酶对抗体的消化还产生一残余“fc”片段，其得名于它的易结晶性能。胃蛋白酶处理将生成f(ab′)2片段和另一残余的其他片段(被称作pfc′片段)，其中，f(ab′)2片段具有能够与抗原发生交联的两个抗原结合片段。其他的片段可包括双体分子(diabodies)、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段fab、fv和scfv与完整的抗体的区别在于抗体片段仅载有单一抗原结合部位。具有两个结合部位的重组片段已可通过许多方法得到，例如通过化学交联导入至fv的vh的c端的半胱氨酸(cumber等，1992)，或导入至scfv的c端的半胱氨酸(pack和pluckthun，1992)，或者通过fab′的铰链半胱氨酸残基(carter等，1992)。优选的抗体片段保留了抗体的某些或几乎全部选择性结合其抗原或受体的能力。一些优选的片段定义如下(1)fab是含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段。可通过用木瓜蛋白酶对完整抗体进行消化以产生完好的轻链和重链的一部分，从而得到fab片段。(2)fab’是抗体分子的片段，可通过用胃蛋白酶处理完整的抗体，然后进行还原，产生完好的轻链和重链的一部分。由每个抗体分子可获得两个fab’片段。fab′片段与fab片段的区别在于在fab’片段重链ch1区的羧基端多出了一些残基，而该重链ch1区包含一个或多个属于抗体铰链区的半胱氨酸。(3)(fab’)2是用胃蛋白酶处理完整的抗体，但不经过随后的还原而得到的抗体的片段。(fab’)2是由两个二硫键连接在一起的两个fab’片段的二聚体。(4)fv是含有完整抗原识别和结合部位的最小的抗体片段。该区包含紧密的、非共价缔合(vh-vl二聚体)一重链和一轻链可变区。在这样的构型下每个可变区的三个cdr相互作用以确定位于vh-vl二聚体表面的抗原结合部位的范围。6个cdr共同地决定了抗体的抗原结合特异性。但是，尽管单独的可变区对抗原的亲和力比起整个结合部位而言要低，一单独的可变区(或仅包含3个对抗原特异的cdr的fv的一半)也能够识别和结合抗原。在本发明的一实施方式中，抗体为单链抗体(“sca”)，其被定义为经过基因工程的分子，含有轻链可变区、重链可变区，并由适当的连接多肽连接以作为基因融合的单链分子。这样的单链抗体被称为“单链fv”或“sfv”抗体片段。通常，fv多肽进一步包含在vh和vl之间的连接多肽，其使得sfv能够形成用于抗原结合的期望的结构。本发明的抗体片段可通过任何本领域技术人员熟知的适当方法进行制造。已有一些微生物的表达系统被发展以产生活性抗体片段，例如，在各种宿主中生成fab已描述于如大肠杆菌(better等，1988，skerra和pluckthun，1988，carter等，1992)、酵母(horwitz等，1988)和丝状真菌里氏木霉(trichodermareesei)(nyyssonen等，1993)。在这些可替代系统中可获得相对较高产率的重组蛋白(在高细胞浓度发酵中的大肠杆菌的周质空间中分泌的fab为1-2g/l，参见carter等，1992)，或者获得相对较低水平的产率，例如，对于发酵物中的酵母中的fab约为0.1mg/l，或者对于融合蛋白cbhi-fab为150mg/l，而对于发酵物中的木霉属(trichoderma)的fab为1mg/l(nyyssonen等，1993)。并且，通过这样来生产fab比起在哺乳动物细胞(杂种瘤，骨髓瘤，中华仓鼠卵巢)中生成完整抗体而言是非常便宜的。片段可以fab′s或fv′s的形式产生，但vh和vl可通过柔性连接多肽而以任何顺序在基因水平上进行连接，这样的组合被称为scfv。分离的核酸分子/载体/宿主细胞(isolatednucleicacidmolecule/vector/hostcell)在一方面，本发明涉及分离的核酸分子，其编码上述定义的结合部分的至少一部分。在一实施方式中，该核酸分子编码轻链，而另一核酸编码重链。两核酸分子可以为分离的，或者也可以是融合到一个核酸分子中，且可通过一连接序列而间隔开。特别是在涉及抗体片段时，核酸分子可以是编码整个结合部分；然而取决于对结合部分的设计，这也可能适用于某些较大的结合部分。核酸分子优选为dna序列，更优选为在其上游包含调节部分，且一旦在该核酸分子进入到宿主细胞后该调节部分促进结合部分表达的dna序列。因此，本发明的一实施方式涉及多聚核苷酸，以及其互补链，其中，该多聚核苷酸选自由以下多聚核苷酸组成的组i)多聚核苷酸，其包含选自实施例6的核苷酸序列中的序列多聚核苷酸，其编码的结合部分包含选自seqidno3，4，12或13组中一个或多个氨基酸序列，ii)多聚核苷酸，其编码由i)中的多聚核苷酸编码的多肽的片段，其中，所述片段a)可识别也能够被ii)中的结合部分识别的抗原，和/或b)可选自性地与抗原结合，其中，所述抗原也与ii)中的结合部分选自性地结合，和/或c)由于其结合区包含了预先确定的序列，如seqidno3，4，12或13，从而具有基本相似的或更高的对肺炎球菌溶血素的亲和力，iii)多聚核苷酸，该多聚核苷酸的互补链在严谨条件下与在i)，ii)，iii)中任何一项中定义的多聚核苷酸杂交，且编码iii)中定义的多肽，iv)多聚核苷酸，其包含的核苷酸序列简并为在i)-iv)中任何一项中定义的多聚核苷酸。本发明进一步涉及含有上述定义的核酸分子的载体，该载体可以是含有一个核酸或在同一载体中含有两个或多个核酸。载体优选包含对由核酸分子编码的抗体表达进行调节的核苷酸序列。本发明的另一方面涉及了包含如上定义的核酸分子的宿主细胞。再有，本发明还涉及经改造而表达如上定义的结合部分的细胞系，该细胞系例如可以是鼠科淋巴细胞的杂种瘤和永生化细胞系。细胞系可以是任意适当的细胞系，但优选的是p3细胞系。在另一实施方式中，优选为中华仓鼠卵巢细胞系。结合部分的纯化(purificationofbindingmembers)优选对制成后的本发明的结合部分进行纯化。采用的纯化方法取决于多个因素，包括纯度要求、抗体来源、抗体的期望用途，产生抗体的物种，抗体的类，以及在抗体为单克隆抗体时，抗体的亚类。可采用任何适当的传统纯化包括抗体的多肽的方法，这些方法包括沉淀和柱色谱法，且为提纯领域所熟知的方法，包括交叉流过滤、硫酸铵沉淀、亲和色谱、凝胶电泳等。纯化具有抗免疫球蛋白类抗体的方法可以包含单一纯化步骤或顺序纯化步骤。单步和连续纯化的方法已为提纯领域的技术人员所熟知。在单步纯化过程中，抗体被单个抗免疫球蛋白类抗体特异性地结合。非特异性结合的分子在冲洗步骤中被除去，而特异性结合的分子被特异性地洗提出。在顺序纯化步过程中，抗体被特异性地结合到第一抗免疫球蛋白类抗体，非特异性结合的分子在冲洗步骤中被除去，特异性结合的分子被特异性地洗提出。从第一抗免疫球蛋白类抗体中得到的洗提液再次被第二抗免疫球蛋白类抗体特异性结合。非特异性结合的分子在冲洗步骤中被除去，特异性结合的分子被特异性地洗提出。在一优选的实施方式中，抗体被第一和第二抗免疫球蛋白类抗体顺次纯化，该第一和第二抗免疫球蛋白类抗体选自由特异性地结合到重链和轻链恒定区的抗体组成的组。通常使用的一种纯化方法是亲和色谱，在该方法中，待纯化的抗体被蛋白a，蛋白g或抗-免疫球蛋白类抗体结合。另一种本领域熟知的亲和色谱是使抗体特异性地与其各自的抗原结合。特别是在纯化多特异性，包括双特异性抗体时，可采用顺序纯化的方法。在该方法中，包含了两个或多个可变区的双特异性抗体先后被第一抗原和第二抗原特异性地结合。在另一选择性的实施方式中，通过顺序纯化提纯包含了两个或多个可变区的双特异性抗体。在该方法中，在第一纯化步骤中将抗体特异性地结合到第一抗原，在第二纯化步骤中结合到第二抗原。用抗免疫球蛋白类抗体纯化抗体的方法可以是单步纯化方法或顺序纯化方法。单步和顺序纯化的方法均为提纯领域的技术人员所熟知。在单步纯化方法中，抗体被单个抗-免疫球蛋白类抗体特异性地结合。非特异性结合的分子在冲洗步骤中被除去，而特异性结合的分子被特异性地洗提出。在顺序纯化步过程中，抗体被特异性地结合到第一抗免疫球蛋白类抗体，非特异性结合的分子在冲洗步骤中被除去，特异性结合的分子被特异性地洗提出。从第一抗免疫球蛋白类抗体中得到的洗提液再次被第二抗-免疫球蛋白类抗体特异性结合。非特异性结合的分子在冲洗步骤中被除去，特异性结合的分子被特异性地洗提出。在一优选的实施方式中，抗体被第一和第二抗免疫球蛋白类抗体顺次纯化，该第一和第二抗免疫球蛋白类抗体选自由特异性地结合到重链和轻链恒定区的抗体组成的组。在另一更为优选的实施方式中，抗体被第一和第二抗免疫球蛋白类抗体顺次纯化，该第一和第二抗免疫球蛋白类抗体选自由特异性地结合到igg的重链恒定区和轻链恒定区k(kappa)和λ(lambda)的抗体组成的组。在又一进一步优选的实施方式中，抗免疫球蛋白类抗体选自由特异性地结合到轻链恒定区k(kappa)和λ(lambda)的抗体组成的组。诊断方法(diagnosticmethods)本发明也描述了一诊断系统，优选是以试剂盒的形式以检验链球菌的存在，特别是肺炎链球菌在生物样品中的存在，其中，最好能够根据在此描述的诊断方法测出样品中细菌的存在，尤其是含量。诊断系统包括足以能够进行至少一次检验的本发明的结合部分组合物，优选为独立包装的试剂，更优选为还包含使用说明。生物样品可以是组织、组织提取液、液体样品或体液样品，例如血液、血浆或血清。包装的是指使用固体基质或如玻璃、塑料(例如聚乙烯、聚丙烯或聚碳酸酯)、纸、箔等，它们能够在固定边界内保存本发明的结合部分。因此，包装可以是例如，用于保存毫克量预期的标记好的结合部分制剂的玻璃瓶，或者是有效粘附了，即经连接而可与配体结合的毫克量预期的标记好的结合部分的微量测试孔盘。“使用说明”通常包括描述了试剂浓度或至少一种检验方法的参数，例如试剂和被用于混合的样品的相对量、试剂/样品混合物的维持期间、温度、缓冲条件等的明确表达。本发明的诊断系统优选还包括标记和能够信号传导形成含有结合部分与预选配体的复合的结合反应复合物的指示方法。任何的标记或指示方法均可以连接到或并入诊断方法中使用的表达的多肽或噬菌体粒子。这样的标记在临床诊断化学中为人所熟知。标记手段可以是荧光标记制剂，其化学地结合到抗体或抗原上而不会使它们变性，从而形成荧光染料(染料)，而这是有用的免疫萤光检验法的示踪剂(immunofluorescenttracer)。适当的荧光标记制剂为荧光染料，例如异氰酸荧光素(fluoresceinisocyanate)(fic)、异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyante)(fitc)、5-二甲胺-1-萘磺酰氯(5-dimethylamine-1-naphthalenesulfonylchloride)(dansc)、四甲基异硫氰酸若丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate，tmritc)、丽丝胺(lissamine)、若丹明8200磺酰氯(rhodamine8200sulphonylchloride)(rb200sc)等。在deluca，″immunofluorescenceanalysis″，inantibodyasatool，marchalonis，etal.，eds.，johnwiley&sons，ltd.，pp.189-231(1982)中对萤光免疫检验分析技术进行了描述，在此将其引入作为参考。在优选的实施方式中，指示基团是酶，例如辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)(hrp)、葡糖氧化酶等。在这些例子中，主要的指示基团是酶，如辣根过氧化物酶或葡糖氧化酶，另外，还需要其他的试剂来显示受体-配体复合物(免疫反应物)已经形成。这些辅助hrp的额外试剂包括过氧化氢和氧化染料前体(oxidationdyeprecursor)，如二氨基联苯胺(diaminobenzidine)。辅助葡糖氧化酶的额外试剂是2，2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-g-磺酸(2，2′-amino-di-(3-ethyl-benzthiazoline-g-sulfonicacid)(abts)。放射性元素也是有用的标记试剂，在此对其使用进行示例性说明。代表性的放射标记试剂是产生γ射线的放射性元素。本身发出γ射线的元素，如as124i、125i、128i、132i和51cr代表了一族产生γ射线的放射性元素指示组。其中，特别优选的是125i。另一组有用的标记手段是那些本身发射正电子的元素，例如11c、18f、15o和13n。发射的正电子在与动物体内存在的电子遭遇时产生γ射线。另外，也可使用发射β射线的元素，例如111in或3h。标记，即多肽和蛋白或噬菌体的标记的连接以为人所熟知。例如，可通过代谢并入(metabolicincorporation)培养基中的成分之一，含放射性同位素的氨基酸，而对蛋白进行标记。例如，参见galfreetal.，meth.enzymol.，733-46(1981)。另外，通过活化的功能团而进行蛋白接合(proteinconjugation)或偶联(coupling)的技术在此特别适用。例如，参见aurameas，etal.，scand.j.immunol.，vol.8suppl.77-23(1978)，rodwelletal.，biotech.，3889-894(1984)，以及u.s.pat.no.4,493,795。诊断系统也可包括特异性结合试剂，优选作为一单独的包装。“特异性结合试剂”是能够选择性地结合到本发明的结合部分种(species)或含有该种的复合物的分子，但其本身不是本发明的结合部分。典型的特异性结合试剂是抗体分子，其互补蛋白(complementproteins)或片段，金黄葡萄球菌蛋白a(s.aureusproteina)等。优选的是在该种为复合物的一部分时，特异性结合试剂结合到结合部分种上。在优选的实施方式中，特异性结合试剂是经标记的。但当诊断系统包括未经标记的特异性结合试剂时，该试剂通常被用作扩增工具或试剂。在这些实施方式中，当扩增工具是结合到含反应物种的复合物上时，经标记的特异性结合试剂能够特异性地结合到扩增工具上。本发明的诊断试剂盒可被用于“elisa”的形式，来探测液体样品中预先选择的配体的量。“elisa”是指酶联免疫吸附剂测定，该方法应用结合到固相的抗体或抗原，以及酶-抗原或酶-抗体缀合物(conjugate)来探测和定量样品中存在的抗原。能够直接用于本方法。因此，在一些实施方式中，本发明的结合部分可被固定在固体基质上以形成固体支持，其包括对象诊断系统中的包装。反应试剂通常是通过从水性介质中吸附的方式而固定在一固体基质上，也可以使用其他习知的适用于蛋白和多肽的固定方法。在此介绍典型的吸附方法。有用的固体基质以为本领域习知。这样的材料为水不溶性的，包括交联的葡聚糖，可由pharmaciafinechemicals(piscataway，n.j.)获得，商标名为sephadex；琼脂糖；直径约1微米到约5毫米的聚苯乙烯粒，可由abbottlaboratoriesofnorthchicago，ill.获得；聚氯乙烯、聚苯乙烯、交联的聚丙烯酰胺、硝化纤维-或尼龙基的网状物，例如片状物、条状物或桨状物；或如用聚苯乙烯或聚氯乙烯制的管、盘或微量测试盘的孔。结合部分种、经标记的特异性结合试剂或任何在此描述的诊断系统的扩增试剂均可以溶液的形式提供，可以是液体分散液或基本上干燥的粉末，例如冻干的形式。当指示工具是酶时，也可以提供用于系统的独立包装的酶的底物。在该诊断检验系统中，也可以包括前述微量测试盘的固体支持和一种或多种缓冲剂作为独立包装元素。诊断方法(diagnosticmethods)本发明还构思了各种检验方法，以用于确定通常存在于生物样品中的链球菌，特别是肺炎链球菌的存在以及含量。因此，本发明涉及对个体中与肺炎球菌相关的疾病或病症的探测或诊断，其包括-从所述个体中提供生物样品；-向所述生物样品中加入如上定义的至少一结合部分；-探测结合到所述生物样品上的结合部分，从而探测或诊断疾病或病症。由结合了的结合部分可以直接地或间接地探测出样品中链球菌的量。本领域的技术人员将能够理解在许多已知的临床诊断化学方法中，本发明的结合试剂可用于形成结合反应产物，其含量与样品中的配体量相关。因此，尽管在此得出代表性的检验方法，但本发明并不受限于此。各种异质方案和同质方案，不论是竞争性的还是非竞争性的，均可用于本发明的检验方法中。结合条件应满足维持配体对受体的结合活性。这些条件包括温度在约4～50摄氏度的范围，ph值约在5～9的范围内，离子强度从大致为蒸馏水的水平到约为1摩尔氯化钠的水平。可按免疫领域熟知的对复合物或结合试剂(复合物的受体组分)进行探测步骤。因此，可使用第二结合试剂，如对受体特异性的抗体。再有，也可通过使用经标记的受体分子来探测复合物，从而对该复合物进行标记。在本例中进行的探测包括探测在复合物中存在的标记。其他的诊断方法还可应用本发明一实施方式中的结合部分组合物对交联的配体进行多价键结合，发生多配体和多肽的集聚，从而产生沉淀的聚集物。该实施方式与已知的免疫沉淀方法相当。该实施方式包含将样品与本发明的结合部分组合物混合，形成结合条件下的结合混合物，然后分离出上述形成的结合复合物。通常，分离是通过离心或过滤而从混合物中除去聚集物而完成。结合复合物的存在表明被探测的预选的配体的存在。药物组合物(pharmaceuticalcompositions)在本发明的一优选方面构思了用于在此描述的治疗方法中的药物组合物。本发明的药物组合物包含生理上可耐受的载体和至少一种在此描述的结合部分的种，其溶解或悬浮于其中以作为活性成分。在一优选的实施方式中，除非用药目的是为了启动免疫反应，当用于人类个体进行治疗时，药物组合物不是免疫原性的。本发明的一方面涉及的药物组合物包括至少一种如上所定义的结合部分。在一优选的实施方式中，药物组合物包括如上定义的两种不同的结合部分以增强治疗的效果。在此所用的术语“制药上可接受的”，“生理上可耐受的”以及它们的文法等同物，在用于指组合物、载体、稀释剂和试剂时，可替换使用，均代表能够施予人而不会产生不期望的生理反应，如恶心、头昏和肠胃不适等的材料。含有溶解或悬浮于其中的药物组合物的制备已为本领域所熟知。通常，这样的组合物可以制备成液体溶液或悬浮形式的灭菌注射剂、水溶液型或非水溶液型均可。但也可制备成适用于使用前在液体中形成液体溶液或悬浮液的固体形式。制剂也可被乳化。活性成分可与赋形剂混合。赋形剂是制药学上可接受的且与活性成分相容，其用量适用于在此描述的治疗方法。适合的赋形剂有如水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。此外，如果需要的话，组合物还可含有少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂等，这些物质提高了活性成分的效力。本发明的药物组合物可包括制药上可接受的在此所述成分的盐。制药上可接受的盐包括酸式盐(acidadditionsalts)(与多肽的自由氨基形成的)，该酸式盐是与无机酸，例如盐酸或磷酸，或有机酸，例如乙酸、酒石酸、扁桃酸等形成的。与自由羧基形成的盐也可衍生自无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。生理上可耐受的载体在本领域是熟知的。液体载体的例子有无菌水溶液，其除了含有活性成分和水外，不含其他物质，或含有缓冲液，例如生理学ph值范围内的磷酸钠、生理盐水或两者，如磷酸盐缓冲盐水。另外，水溶液载体可含有多于一种的缓冲盐，以及如氯化钠和氯化钾、葡萄糖、丙二醇、聚乙二醇和其他溶质。液体组合物除了水之外以及在不含水的情况下还可包含液相。这样的其他的液相的例子有甘油、植物油，例如棉籽油、有机酯例如油酸乙酯(ethyloleate)和水油乳液。药物组合物含有本发明的结合部分，其含量通常是单位重量的总的药物组合物中至少含0.1重量百分比的抗体。重量百分比是抗体与总组合物的重量比率。因此，0.1重量百分比是指每100克总组合物中抗体为0.1克。本发明还涉及制备含有本发明抗体的药物或药物组合物，该药物用于与链球菌，特别是肺炎链球菌相关的疾病或病症，如肺炎、脑膜炎和脓毒症的免疫治疗，包含至少一种如上定义的结合部分以及生理上可接受的载体。另外，本发明还涉及上述定义的结合部分在制备治疗与链球菌，特别是肺炎链球菌相关的疾病或病症，如肺炎、脑膜炎和脓毒症的药物组合物中的应用。药物组合物也可以是部分的试剂盒，进一步包含抗生素试剂，例如选自β-内酰胺、头孢菌素、青霉素和胺基糖苷，和/或包含免疫刺激剂(immunostimulatingagent)，例如细胞因子、干扰素、生长因子，如gcsf或gm-csf。部分的试剂盒可用于同时、连续或分别给药。药物组合物还可包括本发明的结合部分与链球菌蛋白肺炎球菌溶血素，特别是作为疫苗的链球菌蛋白肺炎球菌溶血素的组合。已经发现通过组合本发明的结合部分和蛋白肺炎球菌溶血素，组合后产品在赋予免疫性能上强于单独的蛋白肺炎球菌溶血素。这可能是由于蛋白肺炎球菌溶血素通过结合部分而被呈递到免疫系统。在另一实施方式中，本发明的抗体与另一肺炎链球菌抗体的组合，例如与另外的抗肺炎球菌溶血素抗体，如非溶血的抗肺炎球菌溶血素抗体的组合。本发明的抗体还可为在国际专利申请pct/dk2004/000492中描述的抗psaa抗体。治疗方法(therapeuticmethods)本发明的结合部分由于其高亲和力和特异性而在治疗方法中尤为有用。因此，结合部分可被用于与链球菌，特别是肺炎链球菌相关的疾病或病症，如肺炎、脑膜炎和脓毒症的免疫疗法方面。这里与结合部分一同使用的术语“免疫疗法的”或“免疫疗法”同时含有在预防疾病的和治疗疾病方面施用的意思。因此，结合部分可对高危险病人施用，以减轻疾病的患病可能和/或严重程度，也可以对已经显示出主动侵染的病人施用，或给处于感染危险的病人施用。本发明结合部分施用的剂量范围是足以产生病症改善或感染可能性降低的期望的效果的量。通常，剂量会随病人的年纪、状况、性别和疾病程度的不同而不同，可由本领域技术人员确定。在有任何并发症产生的情况下，剂量可由具体的医生进行调整。本发明的结合部分的治疗有效量通常是指当以生理上可耐受的组合物施用后，足以获得的抗体的血浆浓度为约0.1μg/ml到约100μg/ml，优选为约1μg/ml到约5μg/ml，通常为约5μg/ml的量。换种表达，即剂量可在约0.1mg/kg到约300mg/kg，优选为约0.2mg/kg到约200mg/kg，最优选为约0.5mg/kg到约20mg/kg范围内变动，每日施用一剂或多剂，并持续一或多天。本发明的结合部分可通过注射或一段时间内连续输液而进行肠胃外的施用。尽管感染可能是全身的感染，从而最常见的是用静脉施用药物组合物来进行治疗，但只要存在对组织的作用能够导致对病症的减轻，则对其他的组织采取其他给药方法也是可行的。因此，本发明的抗体可经肠胃外给药，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内、透皮，且可由(肠壁)蠕动(peristaltic)的方式给药。含有本发明结合部分的药物组合物通常是静脉内施用，例如通过注射单位剂量。术语“单位剂量”当用于指本发明的药物组合物时，指实质上分立的单位，其适合作为受治疗者的单一剂量，每一单位含有预先确定量的活性材料，其经过计算与必要的稀释剂，如载体或赋形剂联合以产生预期的治疗效果。治疗方法可进一步包括施用上述定义的部分试剂盒。被动免疫保护(passiveimmuneprotection)结合部分对于被动免疫保护尤其有用，其中结合部分综合了肺炎球菌溶血素的作用。可按照实施例1中描述的检验对结合部分进行评价。检验结果表明，对肺炎球菌溶血素施用结合部分可延长患肺炎链球菌小鼠的存活，从而诱导被动免疫保护。主动免疫保护(activeimmuneprotection)本发明的抗原表位可被用作疫苗来刺激哺乳动物体内对肺炎球菌溶血素的免疫反应。哺乳动物例如小鼠、狗、猫、猪、马、牛等，优选为人。这样的反应可包括诱导肺炎球菌溶血素的特异性抗体。直接作用于抗原表位的本发明的抗体可按如上所述之方式抑制肺炎球菌溶血素的功能，且免疫还可进一步被用于对由肺炎链球菌引发的感染的预防治疗。肺炎球菌溶血素肽(pneumolysinpeptide)本发明的一方面涉及肺炎球菌溶血素肽，其包括可被本发明结合部分识别的抗原表位。优选的肺炎球菌溶血素肽是片段或变异体，优选含有由seqidno27，28，29，30，31，32，33，34，35或36确定的氨基酸序列。根据本发明的肺炎球菌溶血素肽可是由seqidno11的氨基酸1-436组成的肽，这包括了含有氨基酸50-436的片段，或更优选的含有由seqidno11确定的肺炎球菌溶血素的氨基酸100-436。在具体的实施方式中，肺炎球菌溶血素肽包含由seqidno11确定的肺炎球菌溶血素的氨基酸200-436或300-436。肺炎球菌溶血素肽的变异体或同源物(homologues)可被定义为与上述结合部分相关的同源物。肺炎球菌溶血素肽、片段或变异体优选含有由seqidno27，28，29，30，31，32，33，34，35或36确定的氨基酸序列。优选的是肺炎球菌溶血素肽由最多到100个，例如80，60，40，30，25，20，15或如12个氨基酸组成。还优选的是，肺炎球菌溶血素肽由至少为12个，例如15，20，25，30，40，60，80，或例如至少为100个氨基酸组成。在具体实施例方式中，肺炎球菌溶血素肽片段由seqidno27，29，30，31或32确定。肺炎球菌溶血素肽可被用作能刺激免疫系统的抗原表位。疫苗组合物(vaccinecomposition)根据本发明的疫苗组合物可根据已知的方法进行设计，例如，混合一种或多种制药上可接受并含活性成分的赋形剂或载体，优选适用于人类给药。这样的赋形剂、载体和设计方法可在如remington′spharmaceuticalsciences(maackpublishingco，easton，pa)中找到。在配制适用于有效给药的制药上可接受的组合物时，这样的组合物含有根据本发明的有效量的肺炎球菌溶血素肽或其类似物。可向个体施用根据本发明的治疗有效量的疫苗组合物。有效量根据各种不同的因素，例如个体状况、体重、性别和年龄的不同而不同。其他的因素还包括施用的方法。下面，疫苗组合物包含对治疗用途有用的，包括刺激免疫反应的组合物。为获得疫苗或免疫组合物，可能需要将肺炎球菌溶血素肽或类似物分子与各种材料，例如佐药、刺激免疫反应的组分和/或载体进行组合。佐药被含在疫苗组合物中以提高特异性免疫反应。上述佐药可以是任何含有佐药效果的本领域熟知的化合物。例如，这样的佐药可以是矿物质、细菌、植物、合成的或源自宿主的，或可以是水包油乳化液。佐药可选自由alk(so4)2、alna(so4)2、alnh4(so4)、硅石、明矾、al(oh)3、ca3(po4)2、高岭土、碳水化合物、氢氧化铝、胞壁酰二肽、n-乙酰基-胞壁酰基-l-苏氨酰基-d-异谷酰胺(n-acetyl-muramyl-l-threonyl-d-isoglutamine(thr-dmp))、n-乙酰基-降胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷酰胺(cgp11687，也称为nor-mdp)、n-乙酰基胞壁酰基-l-丙氨酰-d-异谷酰胺-l-丙胺酸-2-(1′2′-棕榈酰-sn-甘油-3-羟氧磷酰基氧基)-乙胺(n-乙酰基胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷酰胺基-l-丙胺酸-2-(1′2′-二棕榈酰基-sn丙三氧基-3-羟氧磷酰基氧基)-乙胺(cgp19835a，也称为mtp-pe))、在2％的角鲨烯/吐温-80.rtm.乳剂中的ribi(mpl tdm cws)、脂多糖(lipopolysaccharides)和它的各种衍生物，包括脂质a，弗氏完全佐剂(freund′scompleteadjuvant(fca))、弗氏不完全佐剂(freundsincompleteadjuvants)、默克佐剂65(merckadjuvant65)，多聚核苷酸(例如，聚ic和聚au酸)、产自分支杆菌属的腊d、肺结核、在短棒状杆菌(corynebacteriumparvum)中发现的物质、百日咳杆菌(bordetellapertussis)、布氏杆菌属(brucella)中的成员、脂质体或其他脂质乳剂、titermax、iscoms、quila、alun(参见us58767和5,554,372)、脂质体a的衍生物、霍乱毒素衍生物、hsp衍生物、lps衍生物、合成的肽基质或gmdp、白细胞介素1和白细胞介素2。大量的佐药被描述并应用于在实验动物，如小鼠、大鼠和兔中产生抗体。在这些情形下，由于主要目的是获得强的抗体反应，对副作用的耐受性非常高。为了应用以及在药物中应用的许可，特别是应用于人，对疫苗组合物的组分，包括佐药均要求进行很好的表征。另外，还进一步要求组合物具有最低程度的产生任何副作用的危险，例如发生肉芽肿、脓肿或发烧。在一优选的实施方式中，疫苗组合物适用于对人类受治疗者施用，因此，优选的佐药是适用于给人类受治疗者施用的。用于治疗疫苗中的佐药可以是矿物盐，例如氢氧化铝和铝或钙的磷酸盐的凝胶；基于油乳液和表面活性剂的配方，例如mf59(微液洗涤剂稳定的水包油乳剂)、qs21(纯化的皂角苷)、as02(sbas2，水包油乳剂 单磷类脂质a(monophosphoryllipida)(mpl) qs21)、碲铋华isa51和isa-720(稳定的油包水乳剂)、佐药65(含有花生油，单油酸二缩甘露淳(mannidemonooleate)和单硬脂酸铝(aluminummonostearate)、ribi(immunochemresearchinc.，hamilton，utah)；微粒状佐药，例如微毒粒疫苗(virosomes)(载入了流感病毒血凝素(influenzahaemagglutinin)的单层的脂质体载体(unilamellarliposomal)、as04(al盐与mpl)、iscoms(皂角苷和脂质(如胆固醇)的结构复合物)、聚丙交脂-乙交脂共聚物(polyactideco-glycolide(plg))；细菌衍生物(天然的或合成的)，例如单磷酸类脂质a(mpl)、detox(mpl 草分枝杆菌(m.phlei)细胞壁骨架)、agp(rc-529(合成的酰化单糖))、dc_chol(能够自己组织成脂质体的类似脂肪的免疫激剂)、om-174(脂质a的衍生物)、cpg基元(cpgmotifs)(合成的含有免疫刺激性的cpg基元的寡核苷酸)、具有无毒的佐药效果的改进的细菌毒素lt和ct；内源性人免疫调节剂(endogenoushumanimmunomodulators)，例如，hgm-csf或hil-12或一种人内源性免疫调节剂immudaptin(c3d串联排列(c3dtandemarray))；惰性载体，如金粒子。在一些实施方式中，疫苗组合物可进一步包含一种或多种其他的免疫刺激的组分。这些包括但不限于胞壁酰二肽(mdp)；例如n-乙酰基-胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷酰胺(ala-mdp)、n-乙酰基-胞壁酰基-l-苏氨酰基-d-异谷酰胺(thr-mdp)、n-乙酰基-降胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷酰胺(cgp11637，nor-mdp)和n-乙酰基-胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷酰胺基-l-丙胺酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟氧磷酰基氧基)-乙胺(cgp19835a，mtp-pe)、二甲基氨基乙酸(dimethylglycine)、促吞噬肽(tuftsin)，和海藻糖二霉菌素(trehalosedimycolate)。单磷酸类脂质a(mpl)和含有三肽如n-的甲酸基l-met-leu-phe的甲酸基-蛋氨酸(formyl-methionine)。这样的化合物例如可从sigmachemicalco.(st.louis，mo)和ribiimmunochemresearch，inc.(hamilton，mt)获得。载体可独立于佐药存在。载体的功能例如可以是增加特定存活的片段的分子量从而增加它们的活性或免疫原性(immunogenicity)、赋予稳定性、增加生物活性，或延长血清半衰期(serumhalf-life)。载体可以是任何本领域技术人员已知的适当的载体。载体蛋白可以但不限于匙孔血蓝蛋白(keyholelimpethaemocyanin)、血清蛋白，例如铁传递蛋白(transferrin)、牛血清白蛋白(bovineserumalbum)、人血清白蛋白(humanserumalbumin)、甲状腺球蛋白(thyroglobulin)或卵清蛋白(ovalbumin)、免疫球蛋白或荷尔蒙，例如胰岛素或棕榈酸。在人的免疫中，载体必须是生理上可为人接受的安全的载体。但是，破伤风类毒素(tetanustoxoid)和/或白喉类毒素(diptheriatoxoid)在本发明的一实施方式中为适合的载体。还有，载体可以是葡聚糖，例如琼脂糖。在一实施方式中，疫苗组合物含有肺炎球菌溶血素肽，其包含由seqidno27，28，29，30，31或32确定的氨基酸序列。含有包含了由seqidno29，30或31确定的氨基酸序列的肽的疫苗是优选的。特别优选的的肽包含了由seqidno11确定的肺炎球菌溶血素的氨基酸序列400-436、422-436或425-436。优选的是肺炎球菌溶血素肽由最多到100个，例如80，60，40，20，15，12，10，8或如6个氨基酸组成。还优选的是，肺炎球菌溶血素肽由至少为6个，例如8，10，12，15，20，25，30，40，60，80，或例如至少为100个氨基酸组成。在一实施方式中，疫苗组合物含有至少由seqidno27，28，27，30，31，32，33，34，35或36确定的肺炎球菌溶血素肽。包含由seqidno28，29，30或31确定的肽的疫苗是优选的。特别优选的肽包含由seqidno11确定的肺炎球菌溶血素的氨基酸序列aa423-438，424-437，425-436或426-436。能够刺激免疫反应(immuneresponse)的疫苗组合物是优选的。特别相关的是免疫组合物能够在施用后启动抗体反应。最为优选的是能够启动肺炎球菌溶血素抑制反应的疫苗，其促使了能够抑制肺炎球菌溶血素的细胞溶解活性的抗体的产生。另外的优选实施方式包括的抗体能够增强对肺炎球菌溶血素的吞噬作用。这样的抗体可被表征为包含同在此所述的结合部分的可变区。附图的详细说明图1.fab片段的示意图。示出了vl，cdr1，cdr2，cdr3和由vh，cdr1，cdr2，cdr3组成的抗原口袋(pocket)。图2.具有seqidno11的肺炎球菌溶血素氨基酸序列。示出了对应于基因库no.x52474的序列的肺炎球菌溶血素氨基酸序列。图3.抗肺炎球菌溶血素轻链和重链可变片段。图3a包括抗体26-5f12.1的可变轻链和重链的一致序列以及互补决定区。图3b包括抗体26-23c2.2的可变轻链和重链的一致序列以及互补决定区。图3c包括抗体22-1c11的可变轻链和重链的一致序列以及互补决定区。序列的获取按实施例6所描述进行。图4.接种了肺炎球菌和抗体的小鼠的生存图。对单独注射了肺炎球菌d39或与青霉素和/或肺炎球菌溶血素抗体(26-5f12)组合后注射的小鼠的存活的评价按实施例1中所描述的在接种后24小时进行。图5.肺炎球菌溶血素抗体的抗溶血活性。按实施例3中所描述，通过评价对肺炎球菌溶血素介导的红血球溶解的抑制效果来分析肺炎球菌溶血素抗体的抗溶血活性。其中，三种抗体(26-5f12，26-23c2和22-6e6)尤为有效。图6.表位定位(epitopemapping)用肽。对肺炎球菌溶血素的氨基酸序列419-446和各种表位定位用肽的序列的归纳。图7.肺炎球菌溶血素抗体表位图7a和图7b是对实施例7中描述的与确定抗体表位相关的结果的图示。图8.26-5f12克隆的分离。图8a示出了从26-5f12杂种瘤细胞中分离出的全部rna。rna被用于重链和轻链可变区的cdna合成。pcr的产物示于图8b中。克隆完成后，用菌落pcr(colonypcr)确定阳性转化株(positivetransformants)(图8c)。图9.26-23c2克隆的分离。图9a示出了从26-23c2杂种瘤细胞中分离出的全部rna。rna被用于重链和轻链可变区的cdna合成。pcr的产物示于图9b中。克隆完成后，用菌落pcr确定阳性转化株(图9c)。图10.221c11克隆的分离。由221c11杂种瘤细胞中分离出的全部rna被用于重链和轻链可变区的cdna合成。pcr的产物示于图10a。克隆完成后，用菌落pcr确定阳性转化株(图10b)。图11.26-5f12，26-23c2和22-1c11的cdr序列。对26-5f12，26-23c2和22-1c11的轻链和重链的cdr序列进行了排列。26-5f12和26-23c2的重链几乎相同，而22-1c11重链的cdr2和cdr3与6-5f12和26-23c2的序列不同。实施例以下通过实施例对本发明做进一步解释，但实施例并不理解为对本发明的限制。实施例1抗体和青霉素对接种了肺炎球菌d39(2型)的转基因雌性小鼠的存活影响的研究材料●82只转基因雌性小鼠(m-b项目编号#249，项目名称cd64，约8-12周大)●0.9％生理盐水(从s)●pbsph7.4●注射器●针●5％血平板(bloodplates)●过滤的牛培养基●青霉素溶液(solventadpenicillin)●青霉素1百万iu(lvend6726)，10mg/鼠-40mg/ml菌株肺炎球菌d39(2型)(f1/s1/ae2)抗体pdb26-5f12.1，1.0mg/ml040520ompa6-4b6.1，1.38mg/ml方法24小时将肺炎球菌菌株接种到3×5％的血平板上，并在35℃/co2下培养过夜。0小时肺炎球菌菌株在过滤的培养基中成浆，浓度达到108cfu/ml(cf.mu/f074-01)，稀释到2×105cfu/ml(120μl108cfu/ml在59.88ml的pbs中)。抗体稀释到200μg/ml3.00ml的pdb26-5f12.1 12.00ml的pbs2.17ml的ompa6-4b6.1 12.83ml的pbs小鼠用细菌(0.5mli.p.)和抗体(0.5mli.p.)进行治疗。18小时青霉素将1安瓿稀释到3ml的青霉素溶液，-200mg/ml；进一步稀释3ml“200mg/ml” 12.00ml生理盐水，-40mg/ml.抗体稀释到200μg/ml3.00ml的pdb26-5f12.1 12.00ml的pbs2.17ml的ompa6-4b6.1 12.83ml的pbs小鼠用青霉素(0.25mls.c.)和抗体(0.5mli.p.)进行治疗。48小时青霉素将1安瓿稀释到3ml的青霉素溶液，-200mg/ml；进一步稀释3ml“200mg/ml” 12.00ml生理盐水，-40mg/ml.小鼠用青霉素(0.25mls.c.)进行治疗。在随后几天的实验期间的早晨和下午根据等级1-4对小鼠评分。结果评价24小时小鼠的存活。用26-5f12.1进行实验的结果总结于图4中，图中显示出24小时存活率的增加。实施例2对培养上清夜中的抗体的抗溶血性能的检测。说明肺炎球菌溶血素的抗体可抑制肺炎球菌溶血素的细胞溶解的作用。细胞溶解的作用在有血清存在下而被消除，因此有必要在进行抗溶血检验之前，结合抗体和洗去血清。设备孵育器37℃吸液管离心分离机elisa读取仪，bio-tekel800数字相机，canonpowershots20材料吸管尖(tips)试剂盘(reagenttray)盘盖(platecover)96-孔微孔板(microwellplate)(nunc260836平底)reacti-bind蛋白g涂布的微孔条(microwellstrips)，pierceno.15133试剂rec.pdb，稀释于pbsw.10mmdtt到4μg/ml二硫苏糖醇(dtt)pbs，ph7.4dem.h2o羊红细胞，50％在alsever羊血保存液中，ssino.29431缓冲液pbsph7.4pbsph7.4与0.05％吐温20对照传染性的阴性pbsph7.4与0.05％吐温20红血球溶解pbsph7.4与0.05％吐温20强阳性在pbs中稀释pdb22-6e6到10μg/ml弱阳性在pbs中稀释pdb22-6e6到2μg/ml样品样品是未稀释的培养上清液，抗体浓度预期为1-5μg/ml。过程在pbs/0.05％吐温20中洗条3次。加入50μl/孔的pbs/0.05％吐温20，然后再加入50μl/孔的未稀释的培养上清液或50μl/孔的对照。室温下温育1小时。用pbs洗4次(无吐温20)向每个孔中加入50μlpbs，a1-b1中加入100μl/每孔。在预热的pbs中稀释重组pdb到4μg/ml，用10mmdtt(最终浓度)在37℃下活化15分钟。除了a1-b1外，加入50μl/孔的活化的pdb。在37℃下温育30分钟。羊红细胞在pbs中洗3次，然后再制成2％vol/vol的pbs悬浮液。向每孔中加入50μl，在37℃下活化30分钟。将板以1000xg离心分离5分钟。获取板的数字图像。仔细转移100μl的上清液到平底的微孔中，并在405nm处读取od值。实施例3对抗体抑制肺炎球菌溶血素的溶血活性能力的确定说明经纯化的抗肺炎球菌溶血素的抗体可抑制红细胞上出现的溶胞作用，其代表了一种抗体筛选的功能性检验。设备孵育器37℃吸液管离心分离机elisa读取仪，bio-tekel800数码相机，canonpowershots20材料吸管尖试剂盘盘盖96-孔微孔板(nunc260170-u型)96-孔微孔板(nunc260836平底)试剂rec.肺炎球菌溶血素(ply)或rec.肺炎球菌溶血类毒素(pdb)pdb批号p011030.2mg/ml溶于pbs，稀释到10μg/ml二硫苏糖醇(dtt)pbs，ph7.4dem.h2o羊红细胞，50％在alsever羊血保存液中，ssino.29431缓冲液pbsph7.4pbs与10mmdtt样品纯化的抗体样品用pbs稀释。过程确定溶血终点对每一批新的ply或pdb进行测定。所有的样品均测定3次。对照物是空白100μl缓冲液(0％红血球溶解)总计100μldem.h2o(100％红血球溶解)在pbs和10mmdtt中制备一系列稀释的ply/pdb40-20-10-5-2，5-1，25-0，625-0，3125μg/ml。向每个孔中加入100μl，37℃下温育15分钟。羊红细胞(50％)在pbs中洗3次，并恢复到2％vol/vol。向每个孔中各加入50μl，37℃下温育30分钟。在1000xg离心分离5分钟。获取板的数码图像。转移100μl的上清液到平底的微孔板中，并在405nm处读取值。以两倍肺炎球菌溶血素的浓度得到90％红血球溶解，被用作抑制检验中的标准浓度。抑制检验所有测试均在圆底微孔板中重复进行。对照物空白＝100μlpbs总计红血球溶解＝100μldem.h2o阴性＝50μl肺炎球菌溶血素 50μlpbs肺炎球菌溶血素集合体pdb031201，0.5mg/ml，稀释到20μg/ml＝1μg/孔ply/pdb在预热的pbs中稀释，并在37℃下用10mmdtt(最终浓度)活化15分钟。在加入50μl活化的ply/pdb后，再向每个孔中加入50μl稀释的抗体。板在37℃下温育30分钟。羊红细胞(50％)在pbs中洗3次，并恢复到2％vol/vol。向每个孔中各加入50μl，37℃下温育30分钟。在1000xg离心分离5分钟。获取板的数码图像。转移100μl的上清液到第二个平底的微孔板中(板2)，并在405nm处读取值(表1中给出了例子)。确定出抑制50％红血球溶解的稀释抗体的滴定量，结果示于表4中。样品所有纯化的抗体均在pbs中稀释到500μg/ml。s1＝ra-a-肺炎球菌溶血素s2＝ompa17-10c7031024s3＝22-6e6.5040224s4＝26-5f12.1040520s5＝26-23c2.2040319s6＝26-18g8.2040319s7＝26-30h10.2040319s8＝28-10e7.2040514s9＝26-14g4040305s10＝13-2e12.1031105s11＝22-1c11.1031211板的设置板1板2与实施例1到11相关的数据示于下列表中。表1.405nm的od值。红血球溶解的百分比是由获得的数据(表1)计算得到，结果示于下表2中。表2.红血球溶解％抑制的百分比是通过获得的数据(表2)计算得出，并示于下表3中。表3.抑制红血球溶解％该结果的图示在图5中进行了描述。抗体的滴定量基于上述数据进行确定，并总结于下表4中。表4.所选抗体的滴定量。实施例4抗肺炎球菌溶血素人单克隆抗体(humabs)的亲和力特性结合力测量是通过使某一浓度的单克隆抗体流到抗原涂覆的表面进行。方法和材料芯片涂覆材料蛋白-g芯片类型cm5。芯片制造日期sep16，2003涂覆密度fc1&3＝blank，fc2＝6286rus，fc4＝6700rus涂覆条件蛋白浓度＝5μg/ml，稀释缓冲剂＝乙酸钠，ph＝4.5缓冲溶液hbs-ep.反应物抗体(纯化的)1.4e80.94mg/ml2.22-6e62.50mg/ml3.26-23c23.40mg/ml4.26-5f121.26mg/ml5.22-1c115.80mg/ml6.13-2e121.03mg/ml7.10-3g7.21.10mg/ml8.10-5g3.30.82mg/ml9.10-14a5.20.91mg/ml10.10-5g3.21.14mg/ml抗原0.6mg/ml，57kda(全长，带有his-标签)实验条件捕获(ab)浓度20ug/ml浓度，在50ul/min的流速下200ul谛合时间4分钟。解离时间20分钟。芯片再生在75ul/min流速下，每次脉冲流动17ul的50mmnaoh 75nacl结果由此实验获得的估计的亲和力和速率常数列于下表1中。起先几秒内的谛合和解离符合1∶1的郎缪尔(langmuir)模型，可由此获得亲和力和速率常数。表1.肺炎球菌溶血素抗体的亲和力和速率常数。实施例5抗cd64x抗肺炎球菌溶血素5-9a7双特异性抗体的产生人单克隆抗体(humabs)、抗cd64(88.53)和抗肺炎球菌溶血素的f(ab’)2片段可通过胃蛋白酶消化和利用superdex200凝胶过滤色谱纯化为同质性。进行体积排阻hplc测定，得出按照这种分析，两个f(ab’)2片段的纯度均大于95％。88.53的fab’片段是通过用巯基乙醇胺(mea)温和地还原f(ab’)2片段的重链间的二硫键而产生的。具体的还原条件在小式实验中的结合发生前确定。进行体积排阻hplc测定，得出按照这种分析，88.53fab’的纯度大于90％。通过g-25柱色谱，将88.53的fab’片段与游离的mea分离。fab’片段与5，5′二硫双-2-硝基苯甲酸(dinitrothiobenzoate，dtnb)进行温育，以生成fab-tnb缀合物(conjugate)。抗肺炎球菌溶血素抗体的fab’片段是通过用巯基乙醇胺(mea)温和地还原f(ab’)2片段的重链间的二硫键而产生的。具体的还原条件在小式实验中的结合发生前确定。进行体积排阻hplc测定，得出按照这种分析，fab’的纯度大于90％。通过g-25柱色谱，将fab’片段与游离的mea分离，以1∶1的摩尔比率与88.53fab-tnb混合，并在室温下过夜。用superdex200体积排阻色谱从被污染的fab’分子中纯化出双特异性的抗体，用hplc分析纯化的分子。生成抗cd64x抗cd89双特异性抗体，以作为对照。人单克隆抗体(humabs)、抗cd64(88.53)和抗肺炎球菌溶血素的f(ab’)2片段可通过胃蛋白酶消化和利用superdex200凝胶过滤色谱纯化为同质性(homogeneity)。由体积排阻hplc测定出按照这种分析，两个f(ab’)2片段的纯度均大于95％。88.53的fab’片段是通过用巯基乙醇胺(mea)温和地还原f(ab’)2片段的重链间的二硫键而产生的。具体的还原条件在小式实验中的结合发生前确定。进行体积排阻hplc测定，得出按照这种分析，88.53fab’的纯度大于90％。通过g-25柱色谱，将88.53的fab’片段与游离的mea分离。fab’片段与5，5′二硫双-2-硝基苯甲酸(dtnb)16a和16b进行温育，以生成fab-tnb缀合物。14a8的fab’片段是通过用巯基乙醇胺(mea)温和地还原f(ab’)2片段的重链间的二硫键而产生的。具体的还原条件在小式实验中的结合发生前确定。进行体积排阻hplc测定，得出按照这种分析，14a8fab’的纯度大于95％。通过g-25柱色谱，将14a8的fab’片段与游离的mea分离，以1∶1的摩尔比率与88.53fab-tnb混合，并在室温下过夜。用superdex200体积排阻色谱从被污染的fab’分子中纯化出双特异性的抗体，用hplc分析纯化的分子。88.53×14a8双特异性抗体被纯化到近似为同质性。抗cd64x抗肺炎球菌溶血素双特异性抗体双特异性elisa的结合特异性的表征1.用重组的肺炎球菌溶血素涂覆elisa板，50μl/孔，5μg/ml，且在4℃温育过夜。2.用5％的bsa的pbs溶液封闭(blocked)板。3.向板上加入双特异性抗体的滴定剂。对照包括抗cd64x抗cd89双特异性(对照双特异性)和抗cd64ab、88.53或抗肺炎球菌溶血素ab的f(ab’)2片段。4.然后将板与含有融合蛋白的上清液温育，该融合蛋白由连接到人igm的fc部分的可溶性cd64组成。5.最后板与用碱性磷酸酶标记的山羊抗人igm抗体进行温育。用碱性磷酸酶基质探测出阳性孔。抗cd64x抗肺炎球菌溶血素双特异性抗体的结合特异性表征结合到人cd64-转基因鼠的cd64上从cd64转基因鼠或非转基因的同窝出生的鼠中取血，与浓度为30μg/ml的88.53x抗肺炎球菌溶血素双特异性抗体在室温下温育30分钟。血经洗涤后与fitc标记的抗人igg抗体在室温下温育30分钟。红细胞溶解后，对剩下白细胞用流式细胞仪进行染色分析。对应于淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞的种群被分隔开，以用于单独分析。人cd64表达于单核细胞，以及少量地表达于cd64转基因鼠的嗜中性粒细胞。与在人中相同，cd64不被转基因鼠的淋巴细胞表达。双特异性抗体结合到cd64转基因单核细胞和嗜中性粒细胞，但不与任何衍生自非转基因鼠的细胞种群结合。实施例6单克隆抗体测序(sequencingofmonoclonalantibody)对编码本发明抗体的dna按如下所述进行测序，抗体为26-5f12.1。使用stat60试剂(biogenesis)，从杂种瘤细胞中分离出的全部rna，并转化为cdna以作为pcr的模板。琼脂糖凝胶分析表明了从小粒中提取rna具有较高的产率(图(8a)。cdna产生自rna。重链和轻链可变区通过使用amershambiosciences提供的重引物和轻引物混合物而扩增。pcr产物在tris-乙酸-edta琼脂糖凝胶上进行分析。对cdna使用这些引物的pcr产生的带示于图8b中。直接克隆pcr产物的转化效率低，因此pcr产物要经过凝胶纯化后再克隆。在pcr中呈阳性的样品在topota克隆试剂盒(invitrogen)中被克隆于pcr4-topo载体。纯化的vl和vhpcr产物被克隆于测序载体(sequencingvector)，阳性转化株通过菌落pcr确定(图8c)。为每条链选取所有的阳性克隆(通常为3)，并采用正向和逆向测序引物(sequencingprimers)进行测序。采用bigdyev3.1dna测序试剂盒(appliedbiosystems)，通过双脱氧(dideoxy)方法对克隆测序。序列分析确认出了单克隆抗体26-5f12.1的5个正确的克隆用于可变重链，以及7个用于可变轻链。在下文中给出了这些克隆中各自的dna和蛋白序列。单克隆抗体26-5f12.1测序结果26-5f12.1vh克隆4dna序列aggtgcagctgcaggagtcaggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcacggcttctggatacatcttcactagctatgctatacattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgctggctatggtaacacaaaatattcacagaagttccagggcagagtcagcattaccagggacaaatccgcgagcacagcctacatggagttgagcagcctgagatctgaagacacggctgtgtattactgtgcgagaagggggcagcagctggcctttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca26-5f12.1vh克隆4蛋白质序列vqlqesgaevkkpgasvkvsctasgyiftsyaihwvrqapgqrlewmetgwinagygntkysqkfqgrvsitrdksastaymetelsslrsedtavyycarrgqqlafdywgqgttvtvss26-5f12.1vh克隆3dna序列aggtgaagctgcaggagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcacggcttctggatacatcttcactagctatgctatacattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgctggctatggtaacacaaaatattcacagaagttccagggcagagtcagcattaccagggacaaatccgcgagcacagcctacatggagttgagcagcctgagatctgaagacacggctgtgtattactgtgcgagaagggggcagcagctggcctttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca26-5f12.1vh克隆3蛋白质序列vklqesgaevkkpgasvkvsctasgyiftsyaihwvrqapgqrlewmetgwinagygntkysqkfqgrvsitrdksastaymetelsslrsedtavyycarrgqqlafdywgqgttvtvss26-5f12.1vh克隆6dna序列aggtgaagctgcagcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcacggcttctggatacatcttcactagctatgctatacattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgctggctatggtaacacaaaatattcacagaagttccagggcagagtcagcattaccagggacaaatccgcgagcacagcctacatggagttgagcagcctgagatctgaagacacggctgtgtattactgtgcgagaagggggcagcagctggcctttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctc26-5f12.1vh克隆6蛋白质序列vklqqsgaevkkpgasvkvsctasgyiftsyaihwvrqapgqrlewmetgwinagygntkysqkfqgrvsitrdksastaymetelsslrsedtavyycarrgqqlafdywgqgttvtvs26-5f12.1vh克隆15dna序列aggtgaagctgcagcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcacggcttctggatacatcttcactagctatgctatacattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgctggctatggtaacacaaaatattcacagaagttccagggcagagtcagcattaccagggacaaatccgcgagcacagcctacatggagttgagcagcctgagatctgaagacacggctgtgtattactgtgcgagaagggggcagcagctggcctttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctc26-5f12.1vh克隆15蛋白质序列vklqqsgaevkkpgasvkvsctasgyiftsyaihwvrqapgqrlewmetgwinagygntkysqkfqgrvsitrdksastaymetelsslrsedtavyycarrgqqlafdywgqgttvtvs26-5f12.1vh克隆10dna序列aggtgaagctgcaggagtcaggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcacggcttctggatacatcttcactagctatgctatacattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgctggctatggtaacacaaaatattcacagaagttccagggcagagtcagcattaccagggacaaatccgcgagcacagcctacatggagttgagcagcctgagatctgaagacacggctgtgtattactgtgcgagaagggggcagcagctggcctttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca26-5f12.1vh克隆10蛋白质序列vklqesgaevkkpgasvkvsctasgyiftsyaihwvrqapgqrlewmetgwinagygntkysqkfqgrvsitrdksastaymetelsslrsedtavyycarrgqqlafdywgqgttvtvss26-5f12.1vl克隆2dna序列gacatccagatgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcaccattcactttcggccctggcaccaagctggaaatcaaacgg26-5f12.1vl克隆2蛋白质序列diqmettqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspftfgpgtkleikr26-5f12.1vl克隆3dna序列gacatccagatgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcaccattcactttcggccctggcaccaagctggaaatcaaacgg26-5f12.1vl克隆3蛋白质序列diqmettqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspftfgpgtkleikr26-5f12.1vl克隆4dna序列gacatccagatgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcaccattcactttcggccctggcaccaagctggaaatcaaacgg26-5f12.1vl克隆4蛋白质序列diqmettqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspftfgpgtkleikr26-5f12.1vl克隆5dna序列gacatccagatgactcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcaccattcactttcggccctggcaccaagctggaaatcaaacgg26-5f12.1vl克隆5蛋白质序列diqmettqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspftfgpgtkleikr26-5f12.1vl克隆6dna序列gacatccagatgacacagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcaccattcactttcggccctggcaccaagctggaaatcaaacgg26-5f12.1vl克隆6蛋白质序列diqmettqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspftfgpgtkleikr26-5f12.1vl克隆10dna序列gacatccagatgacacagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcaccattcactttcggccctggcaccaagctggaaatcaaacgg26-5f12.1vl克隆10蛋白质序列diqmettqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspftfgpgtkleikr26-5f12.1vl克隆12dna序列gacatccagatgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcaccattcactttcggccctggcaccaagctggaaatcaaacgg26-5f12.1vl克隆12蛋白质序列diqmettqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspftfgpgtkleikr单克隆抗体26-5f12.1一致序列vh一致蛋白质序列vklqesgaevkkpgasvkvsctasgyiftsyaihwvrqapgqrlewmetgwinagygntkysqkfqgrvsitrdksastaymetelsslrsedtavyycarrgqqlafdywgqgttvtvssvl一致蛋白质序列diqmettqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspftfgpgtkleikr26-5f12.1的可变轻链和重链的序列示于图3a中，其中，也包括了cdr的序列。单克隆抗体26-23c2.2序列分析按如上所述提取rna，显示出很高的产率(图9a)。cdna由rna产生。用于扩增vl区域的初始pcr反应不成功。新的引物经排列在分开的反应中来扩增vh和vl。在初始的cdna上使用这些引物的pcr在图9b中给出了vh和vl带。纯化的vh和vlpcr产物被克隆于测序载体，并用菌落pcr确定转化株(图9c)。选出vh和vl克隆，并测序。5个vh克隆和3个vl克隆的序列表示如下。单克隆抗体26-23c2.2测序结果26-23c2.2vh克隆1dna序列aggtgaagctgcaggagtcaggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcacggcttctggatacatcttcactagctatgctatgcattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgctggctatggtaacacaaaatattcacagaagttccagggcagagtcagcattaccagggacaaatccgcgagcacagcctacatggagctgaccagcctgagatctgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaagggggcagcagctggcctttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca26-23c2.2vh克隆1氨基酸序列vklqesgaevkkpgasvkvsctasgyiftsyamhwvrqapgqrlewmgwinagygntkysqkfqgrvsitrdksastaymeltslrsedtavyycarrgqqlafdywgqgttvtvss26-23c2.2vh克隆2dna序列aggtgaaactgcagctgtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcacggcttctggatacatcttcactagctatgctatgcattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgctggctatggtaacacaaaatattcacagaagttccagggcagagtcagcattaccagggacaaatccgcgagcacagcctacatggagctgaccagcctgagatctgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaagggggcagcagctggcctttgactactggggccaagggaccacggtcaacgtctcctca26-23c2.2vh克隆2氨基酸序列vklqlsgaevkkpgasvkvsctasgyiftsyamhwvrqapgqrlewmgwinagygntkysqkfqgrvsitrdksastaymeltslrsedtavyycarrgqqlafdywgqgttvnvss26-23c2.2vh克隆3dna序列aggtcaaactgcaggagtcaggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcacggcttctggatacatcttcactagctatgctatgcattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgctggctatggtaacacaaaatattcacagaagttccagggcagagtcagcattaccagggacaaatccgcgagcacagcctacatggagctgaccagcctgagatctgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaagggggcagcagctggcctttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca26-23c2.2vh克隆3氨基酸序列vklqesgaevkkpgasvkvsctasgyiftsyamhwvrqapgqrlewmgwinagygntkysqkfqgrvsitrdksastaymeltslrsedtavyycarrgqqlafdywgqgttvtvss26-23c2.2vh克隆4dna序列agctcaagctgcaggagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcacggcttctggatacatcttcactagctatgctatgcattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgctggctatggtaacacaaaatattcacagaagttccagggcagagtcagcattaccagggacaaatccgcgagcacagcctacatggagctgaccagcctgagatctgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaagggggcagcagctggcctttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca26-23c2.2vh克隆4氨基酸序列lklqesgaevkkpgasvkvsctasgyiftsyamhwvrqapgqrlewmgwinagygntkysqkfqgrvsitrdksastaymeltslrsedtavyycarrgqqlafdywgqgttvtvss26-23c2.2vh克隆5dna序列aggtgcagctgcaggagtcaggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcacggcttctggatacatcttcactagctatgctatgcattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgctggctatggtaacacaaaatattcacagaagttccagggcagagtcagcattaccagggacaaatccgcgagcacagcctacatggagctgaccagcctgagatctgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaagggggcagcagctggcctttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca26-23c2.2vh克隆5氨基酸序列vqlqesgaevkkpgasvkvsctasgyiftsyamhwvrqapgqrlewmgwinagygntkysqkfqgrvsitrdksastaymeltslrsedtavyycarrgqqlafdywgqgttvtvss26-23c2.2vl克隆2dna序列gacatccgggtgacccagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatacgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaaggtggaaatcaaaa26-23c2.2vl克隆2蛋白质序列dirvtqspaslavslgqratisyrasksvstsgysythwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggprwksk26-23c2.2vl克隆3dna序列gacatccagatgacccagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaagctggagatcaaaa26-2c2.2vl克隆3蛋白质序列diqmtqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpswrsk26-23c2.2vl克隆4dna序列gacatccagttgacccagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaaggtggaaatcaaaa26-23c2.2vl克隆4蛋白质序列diqltqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggprwksk单克隆抗体26-23c2.2一致序列vh一致dna序列aggtgaagctgcaggagtcaggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcacggcttctggatacatcttcactagctatgctatgcattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgctggctatggtaacacaaaatattcacagaagttccagggcagagtcagcattaccagggacaaatccgcgagcacagcctacatggagctgaccagcctgagatctgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaagggggcagcagctggcctttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcavh一致氨基酸序列vklqesgaevkkpgasvkvsctasgyiftsyamhwvrqapgqrlewmgwinagygntkysqkfqgrvsitrdksastaymeltslrsedtavyycarrgqqlafdywgqgttvtvssvl一致dna序列gacatccagdtgacccagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaaggtggaaatcaaaavl一致蛋白质序列diqltqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggprwksk26-23c2的可变轻链和重链的序列示于图3b中，其中也包括了cdr的序列。单克隆抗体221c11序列分析cdna由rna产生。扩增单克隆抗体dna的vh和vl区的pcr反应给出了图10a中的带。纯化的vh和vlpcr产物被克隆于测序载体，并用菌落pcr确定转化株(图10b)。为每条链选取7个vh和6个vl克隆，并采用正向和逆向测序引物进行测序。序列分析确认出了单克隆抗体22-1c11的5个正确的用于vh链的克隆。vl测序效果很差。另外再选取6个克隆，并从所有6个克隆中获得一致序列。阳性vh和vl克隆的dna和蛋白质序列均表示如下。单克隆抗体22-1c11测序结果22-1c11vh克隆1dna序列aggtgcaactgcaggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctaagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaatactatgcagacttcgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaaggggaaattactatggtttggggagcttctactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca22-1c11vh克隆1氨基酸序列vqlqesgggvvqpgrslrlscaasgftfsnygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadfvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarrgnyyglgsfyyygmdvwgqgttvtvss22-1c11vh克隆2dna序列aggtgaagctgcaggagtctgggggaggcgtggcccagcctgggaggtccctaagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaatactatgcagacttcgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaaggggaaattactatggtttggggagcttctactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca22-1c11vh克隆2氨基酸序列vklqesgggvaqpgrslrlscaasgftfsnygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadfvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarrgnyyglgsfyyygmdvwgqgttvtvss22-1c11vh克隆3dna序列aggtccaactgcaggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctaagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaatactatgcagacttcgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaaggggaaattactatggtttggggagcttctactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctc22-1c11vh克隆3氨基酸序列vqlqesgggvvqpgrslrlscaasgftfsnygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadfvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarrgnyyglgsfyyygmdvwgqgttvtvs22-1c11vh克隆4dna序列aggtcaaactgcaggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctaagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaatactatgcagacttcgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaaggggaaattactatggtttggggagcttctactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca22-1c11vh克隆4氨基酸序列vklqesgggvvqpgrslrlscaasgftfsnygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadfvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarrgnyyglgsfyyygmdvwgqgttvtvss22-1c11vh克隆8dna序列aggtgaagctgcaggagtcagggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctaagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaatactatgcagacttcgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaaggggaaattactatggtttggggagcttctactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca22-1c11vh克隆8氨基酸序列vklqesgggvvqpgrslrlscaasgftfsnygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadfvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarrgnyyglgsfyyygmdvwgqgttvtvss22-1c11vl克隆3dna序列gacatccagatgacccagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggcctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggcatccgacgttcggccaaggcaccaagctggaaatcaaacgg22-1c11vl克隆3氨基酸序列diqmtqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgpgtdftltisslepedfavyycqqrsnwhptfgqgtklxnqt22-1c11vl克隆6dna序列acacagtntccngccnccctgtnttngtctncagnggaaaganccaccctntccngcaggnccagtcanagtgttngcagctanttagcctggtaccaacagaaanntggncaggctcccaggctcctcatctatgangcatccaacngggccactggcatcccagccaggttcagnggcagtgggtntgggacagacttcactctcaccatcagcagcntagagcctgaagatttngcagtttattactgtcagcagtgtagcaactggcatccgacattcggccaaggcaccaagctggaaatcaaangn测序效果差。22-1c11vl克隆7dna序列gacatccagatgacccagttccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtgtagcaactggcatccgacgttcggccaaggcaccaagctggaaatcaaacgg22-1c11vl克隆7氨基酸序列diqmtqfqppclclqgkeppspagpvrvlaat*pgtnrnlarlpgsssmmhptgplasqpgsvavglgqtslspsaa*slkilqfitvssvatgirrsakapswksn22-1c11vl克隆11dna序列gacatccagatgacacagtctccagccaccctgtctttgtctncaggggaaagagccaccctctccngcaggnccagtcagagtgttagcagntanttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccanncaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagatttngcagtttattactgtcagcagtgtagcaactggcatcngacattcggccaaggcaccaagctggaaatcaaacgg测序效果差。22-1c11vl克隆12dna序列gacatccagatgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtgtagcaactggcatccgacttcggccaaggcaccaagctggaaatcaaacgg22-1c11vl克隆12氨基酸序列diqmtqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqcsnwhptsakapswksn22-1c11vl克隆14dna序列gacatccagatgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtgtagcaactggcatcngacattcggccaaggcaccaagntggaaancaaacgg22-1c11vl克隆14氨基酸序列diqmtqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqcsnwhltfgqgtk单克隆抗体22-1c11一致序列vh一致dna序列aggtgaaactgcaggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctaagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaatactatgcagacttcgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaaggggaaattactatggtttggggagcttctactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcavh一致氨基酸序列vklqesgggvvqpgrslrlscaasgftfsnygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadfvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarrgnyyglgsfyyygmdvwgqgttvtvssvl一致dna序列gacatccagatgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtgtagtagctggcatccgacattcggccaaggcaccaagctggaaatcaaacggvl一致氨基酸序列diqmtqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqcsnwhptfgqgtkleikr22-1c11的可变轻链和重链的序列示于图3c，其中cdr的序列也包括在内。26-5f12，26-23c2和221c11的cdr序列的排比示于图11。实施例7确认表位位置制备出具有12个氨基酸的肺炎球菌溶血素的合成肽片段，其代表了肺炎球菌溶血素的28个氨基酸残基。肽与周围的片段有至少8个氨基酸残基发生重叠。图6中示出了肽。结合到片段上的抗体在如下描述的标准elisa检验中进行测试。使用的所有肽均为生物素化的肽。设备孵育器37℃吸液管elisa读取仪材料吸管尖试剂盘盘盖reacti-bind链霉抗生物素(streptavidin)hbc涂覆的96-孔微孔板(pierce)试剂兔-α-人igghrp(dakop0214)opd(邻苯二胺)缓冲液洗涤和稀释缓冲液pbs与0.05％吐温20封闭缓冲液洗涤缓冲液加入2％smp(脱脂奶粉)对照物阴性空白阴性psaa肽9144biotin-kdpnnkefyeknlkeytdkldkldk-nh2，1mg/ml040630阳性ply肽10146biotin-ectglawewwrt-oh，5mg/ml肽肽″gnt-01″biotin-rectglawewwr-oh，5mg/ml肽″gnt-02″biotin-irectglaweww-oh，5mg/ml肽″gnt-03″biotin-kirectglawew-oh，50μg/ml肽″gnt-04″biotin-vkirectglawe-oh，50μg/ml肽″gnt-05″biotin-svkirectglaw-oh，50μg/ml肽″gnt-06″biotin-lsvkirectgla-oh，50μg/ml肽″gnt-061″biotin-nlsvkirectgl-oh，50μg/ml肽″gnt-062″biotin-rnlsvkirectg-oh，50μg/ml肽″gnt-07″biotin-ctglawewwrtv-oh，50μg/ml肽″gnt-08″biotin-tglawewwrtvy-oh，50μg/ml肽″gnt-09″biotin-glawewwrtvye-oh，50μg/ml肽″gnt-10″biotin-lawewwrtvyek-oh，50μg/ml肽″gnt-13″biotin-ewwrtvyektdl-oh，50μg/ml肽″gnt-14″biotin-wwrtvyektdlp-oh，50μg/ml过程用洗涤缓冲液认真润洗涂覆的板，每个孔用量为3×300μl。所有的肽均在pbs中稀释到2.5μg/ml。每孔中加入100μl，将板在室温下温育1小时。如下给出步骤安排。用流动的洗涤缓冲液润洗板，每孔用量为3×200μl，并在室温下用含有2％smp的洗涤缓冲液进行封闭30分钟。然后，各孔用3×200μl的洗涤缓冲液润洗。所有的单克隆抗体均稀释到0.5μg/ml，并向每个孔中加入100μl，板在37℃下温育1小时。按如下所述应用抗体。用洗涤缓冲液润洗板，每孔用到2×200μl的洗涤缓冲液。将第二抗体兔-α-人igghrp(dakop0214)在封闭缓冲液中进行1∶2000的稀释，向每孔中加入100μl，然后板在37℃下温育30分钟。每孔用3×200μl的洗涤缓冲液润洗，并用opd显影30分钟。进行3个独立实验，列出结果如下。板1的总的结果示于图7a中，板2的结果示于图7b中。肽的配置(板1)肽的配置(板2)肽的配置(板2持续)对两板的抗体的配置elisa读数(板1)板1的elias读数汇总板2的elias读数板2的elias读数(继续)板2的elias读数汇总板2(继续)读数结果的图示说明示于图7a及图7b參考文獻alexander，j.e.，r.a.lock，c.a.m.peeter，j.t.poolman，p.w.andrew，t.j.mitchell，d.hansman，andj.c.paton.1994.immunizationofmicewithpneumolysintoxoidconfersasignificantdegreeofprotectionagainstatleastnineserotypesofstreptococcuspneumoniae.infect.immun.625683alonsodevelasco，e.streptococcuspneumoniaevirulencefactors，pathogenesis，andvaccines.microbiol.rev.1995.dec.59591-603.anonymous.1985.acuterespiratoryinfectionsinunderfives15milliondeathsayear.lancet2699-701.barry，a.m.，r.a.lock，d.hansman，andj.c.paton.1989.contributionofautolysintovirulenceofstreptococcuspneumoniae.infect.immun.572324-2330.bentonetal.1997.differencesinvirulenceformiceamongstreptococcuspneumoniaestrainsofcapsulartypes2，3，4，5and6arenotattributabletodifferencesinpneumolysinproduction.infect.immun.651237-1244.bonev，b.b.，gilbert，r.j.c.，andrew，p.w.etal.2001.structuralanalysisoftheprotein/lipidcomplexesassociatedwithporeformationbythebacterialtoxinpneumolysin.j.biol.chem.276(8)5714-5719.camara，m.，g.j.boulnois，p.w.andrew，andt.j.mitchell.1994.aneuraminidasefromstreptococcuspneumoniaehasthefeaturesofasurfaceprotein.infect.immun.623688-3695.crainmj，etal.pneumococcalsurfaceproteina(pspa)isserologicallyhighlyvariableandisexpressedbyallclinicallyimportantcapsularserotypesofstreptococcuspneumoniae.infect.immun1990.oct.583293-3299.delostoyosjr，etal.functionalanalysisofpneumolysinbyuseofmonoclonalantibodies.infect.immun.1996.feb.64480-484.kuo，j.，m.douglas，h.k.ree，anda.a.lindberg.1995.characterizationofarecombinantpneumolysinanditsuseasaproteincarrierforpneumococcaltype18cconjugatevaccines.infect.immun.632706-2713.leecj，etal.immunologicepitope，gene，andimmunityinvolvedinpneumococcalglycoconjugate.crit.rev.microbiol.1997.23121-142.lock，r.a.，j.c.paton，andd.hansman.1988.comparativeefficacyofpneumococcalneuraminidaseandpneumolysinasimmunogensprotectiveagainststreptococcuspneumoniae.microb.pathog.5461-467.lomholdt，h.1995.evidenceofrecombinationandanantigenicallydiverseimmunoglobulina1proteaseamongstrainsofstreptococcuspneumoniae.infect.immun.634238-4243.mcdaniells，etal.monoclonalantibodiesagainstprotease-sensitivepneumococcalantigenscanprotectmicefromfatalinfectionwithstreptococcuspneumoniae.j.exp.med.1984.aug.1.160386-397.mcdaniells，etal.pspa，asurfaceproteinofstreptococcuspneumoniae，iscapableofelicitingprotectionagainstpneumococciofmorethanonecapsulartype.infect.immun.1991.jan.59222-228.mitchell，t.j.，f.mendez，j.c.paton，p.w.andrew，andg.j.boulnois.1990.comparisonofpneumolysingenesandproteinsfromstreptococcuspneumoniaetype1and2.nuclei.acids.res.184010musher，d.m.，mediwala，r.，phan，h.m.etal.2001.nonspecificityofassayingforiggantibodytopneumolysinincirculatingimmunecomplexesasameanstodiagnosepneumococcalpneumonia.clin.infect.dis.32534-538.paton，j.c.，r.a.lock，andd.hansman.1983.effectofimmunizationwithpneumolysinonsurvivaltimeofmicechallengedwithstreptococcuspneumoniae.infect.immun.40548paton，j.c.，r.a.lock，c.j.lee，j.p.li，a.m.barry，t.j.mitchell，p.w.andrew，d.hansman，andg.j.boulnois.1991.purificationandimmunogenicityofgeneticallyobtainedpneumolysintoxoidsandtheirconjugationtostreptococcuspneumoniaetype19fpolysaccharide.infect.immun.592297-2304.rapola，s.，jnnti，v.，haikala，r.，carlone，g.m.，sampson，j.s.，briles，d.e.，paton，j.c.，takala，a.k.，kilpi，t.m.，andkyhty，h.2000.naturaldevelopmentofantibodiestopneumococcalsurfaceproteina，pneumococcalsurfaceadhesina，andpneumolysininrelationtopneumococcalcarriageandacuteotitismedia.j.infect.dis.1821146-1152.simell，b.，korkeila，m.，pursiainen，h.，kilpi，t.m.，andkyhty，h.2001.pneumococcalcarriageandotitismediainducesalivaryantibodiestopneumococcalsurfaceadhesina，pneumolysin，andpneumococcalsurfaceproteinainchildren.j.infect.dis.183887-896.sorensen，u.b.pneumococcalpolysaccharideantigenscapsulesandc-poly-saccharide.animmunochemicalstudy.dan.med.bull.1995.feb.4247-53.swiatlo，e.，m.j.crain，l.s.mcdaniel，a.brooks-walter，t.j.coffey，b.g.spratt，d.a.morrison，andd.e.briles.1996.dnapolymorphismsandvariantspenicillin-bindingproteinsasevidencethatrelativelypenicillin-resistantpneumococciinwesterncanadaareclonallyrelated.j.infect.dis.174884-888.tai，s.s.，t.r.wang，andc.j.lee.1997.characterizationofheminbindingactivityofstreptococcuspneumoniae.infect.immun.651083talkingtondf，etal.a43-kilodaltonpneumococcalsurfaceprotein，pspaisolation，protectiveabilities，andstructuralanalysisoftheamino-terminalsequence.infect.immun.1991.apr.591285-1289.序列表<110>genestoa/s<120>肺炎球菌溶血素的结合部分<130>p885pc00<160>26<170>patentinversion3.1<210>1<211>12<212>prt<213>人类<400>1ileargglucysthrglyleualatrpglutrptrp1510<210>2<211>16<212>prt<213>人类<400>2vallysileargglucysthrglyleualatrpglutrptrpargthr151015<210>3<211>109<212>prt<213>人工序列<220><223>可变轻链26-5f12.1<400>3aspileglnmetthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalserserser202530tyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu354045iletyrglyalaserserargalathrglyileproaspargpheser505560glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu65707580progluaspphealavaltyrtyrcysglnglntyrglyserserpro859095phethrpheglyproglythrlysleugluilelysarg100105<210>4<211>117<212>prt<213>人工序列<220><223>可变轻链26-5f12.1<400>4vallysleuglngluserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercysthralaserglytyrilephethrsertyrala202530ilehistrpvalargglnalaproglyglnargleuglutrpmetgly354045trpileasnalaglytyrglyasnthrlystyrserglnlysphegln505560glyargvalserilethrargasplysseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysala859095argargglyglnglnleualapheasptyrtrpglyglnglythrthr100105110valthrvalserser115<210>5<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr1轻链26-5f12.1<400>5argalaserglnservalsersersertyrleuala1510<210>6<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr2轻链26-5f12.1<400>6glyalaserserargalathr15<210>7<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr3轻链26-5f12.1<400>7glnglntyrglyserser15<210>8<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr1重链26-5f12.1<400>8sertyralailehis15<210>9<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr2重链26-5f12.1<400>9trpileasnalaglytyrglyasnthrlystyrserglnlys1510<210>10<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr3重链26-5f12.1<400>10argglyglnglnleualapheasptyrtrpglyglnglythrthrval151015thr<210>11<211>471<212>prt<213>人类<400>11metalaasnlysalavalasnasppheileleualametasntyrasp151015lyslyslysleuleuthrhisglnglygluserilegluasnargphe202530ilelysgluglyasnglnleuproaspgluphevalvalilegluarg354045lyslysargserleuserthrasnthrseraspileservalthrala505560thrasnaspserargleutyrproglyalaleuleuvalvalaspglu65707580thrleuleugluasnasnprothrleuleualavalaspargalapro859095metthrtyrserileaspleuproglyleualaserseraspserphe100105110leuglnvalgluaspproserasnserservalargglyalavalasn115120125aspleuleualalystrphisglnasptyrglyglnvalasnasnval130135140proalaargmetglntyrglulysilethralahissermetglugln145150155160leulysvallyspheglyserasppheglulysthrglyasnserleu165170175aspileasppheasnservalhisserglyglulysglnileglnile180185190valasnphelysglniletyrtyrthrvalservalaspalavallys195200205asnproglyaspvalpheglnaspthrvalthrvalgluaspleulys210215220glnargglyileseralagluargproleuvaltyrileserserval225230235240alatyrglyargglnvaltyrleulysleugluthrthrserlysser245250255aspgluvalglualaalapheglualaleuilelysglyvallysval260265270alaproglnthrglutrplysglnileleuaspasnthrgluvallys275280285alavalileleuglyglyaspproserserglyalaargvalvalthr290295300glylysvalaspmetvalgluaspleuileglngluglyserargphe305310315320thralaasphisproglyleuproilesertyrthrthrserpheleu325330335argaspasnvalvalalathrpheglnasnserthrasptyrvalglu340345350thrlysvalthralatyrargasnglyaspleuleuleuasphisser355360365glyalatyrvalalaglntyrtyrilethrtrpaspgluleusertyr370375380asphisglnglylysgluvalleuthrprolysalatrpaspargasn385390395400glyglnaspleuthralahisphethrthrserileproleulysgly405410415asnvalargasnleuservallysileargglucysthrglyleuala420425430trpglutrptrpargthrvaltyrglulysthraspleuproleuval435440445arglysargthrileseriletrpglythrthrleutyrproglnval450455460gluasplysvalgluasnasp465470<210>12<211>110<212>prt<213>人工序列<220><223>可变轻链26-23c2.2<400>12aspileglnleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesertyrargalaserlysservalserthrser202530glytyrsertyrmethistrpasnglnglnlysproglyglnpropro354045argleuleuiletyrleuvalserasnleugluserglyvalproala505560argpheserglyserglyserglythraspphethrleuasnilehis65707580provalgluglugluaspalaalathrtyrtyrcysglnhisilearg859095gluleuthrargsergluglyglyproargtrplysserlys100105110<210>l3<211>117<212>prt<213>人工序列<220><223>可变重链26-23c2.2<400>13vallysleuglngluserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercysthralaserglytyrilephethrsertyrala202530methistrpvalargglnalaproglyglnargleuglutrpmetgly354045trpileasnalaglytyrglyasnthrlystyrserglnlysphegln505560glyargvalserilethrargasplysseralaserthralatyrmet65707580gluleuthrserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysala859095argargglyglnglnleualapheasptyrtrpglyglnglythrthr100105110valthrvalserser115<210>14<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr1轻链26-23c2.2<400>14argalaserlysservalserthrserglytyrser1510<210>15<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr2轻链26-23c2.2<400>15leuvalserasnleugluser15<210>16<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr3轻链26-23c2.2<400>16glnhisilearggluleu15<210>17<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr1重链26-23c2.2<400>17sertyralamethis15<210>18<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr2重链26-23c2.2<400>18trpileasnalaglytyrglyasnthrlystyrserglnlys1510<210>19<211>108<212>prt<213>人工序列<220><223>可变轻链22-1c11<400>19aspileglnmetthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalsersertyr202530leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile354045tyraspalaserasnargalathrglyileproalaargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglupro65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglncysserasntrphispro859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelysarg100105<210>20<211>125<212>prt<213>人工序列<220><223>可变重链22-1cll<400>20vallysleuglngluserglyglyglyvalvalglnproglyargser151015leuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasntyrgly202530methistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalala354045valiletrptyraspglyserasnlystyrtyralaaspphevallys505560glyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyrleu65707580glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala859095argargglyasntyrtyrglyleuglyserphetyrtyrtyrglymet100105110aspvaltrpglyglnglythrthrvalthrvalserser115120125<210>21<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr1轻链22-1c11<400>21argalaserglnservalsersertyrleuala1510<210>22<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr2轻链22-1c11<400>22aspalaserasnargalathr15<210>23<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr3轻链22-1c11<400>23glnglncysserasntrp15<210>24<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr1重链22-1c11<400>24serasntyrglymethis15<210>25<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr2重链22-1c11<400>25valiletrptyraspglyserasnlystyrtyralaaspphe1510<210>26<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr3重链22-1c11<400>26serphetyrtyrtyrglymetaspvaltrpglyglnglythrthrval151015thr权利要求1.分离的抗溶血活性的结合部分，包含至少一结合区，能够特异性地结合肺炎球菌溶血素，其中所述结合区识别位于肺炎球菌溶血素的n-末端部分的对应seqidno11的氨基酸序列1-436的表位。2.根据权利要求1的分离的结合部分，其中，所述结合区识别位于肺炎球菌溶血素的对应seqidno11的氨基酸序列200-436区域的表位。3.根据权利要求1-2的分离的结合部分，其中，分离的结合部分是纯分离的结合部分。4.根据权利要求1-3的分离的结合部分，其中，结合部分是选自抗体或具免疫活性的抗体片段或抗体的单链。5.根据权利要求4的分离的结合部分，其中，抗体是选自单克隆抗体、多克隆抗体或单克隆抗体的混合物。6.根据权利要求1的分离的结合部分，其中，结合部分是对肺炎球菌溶血素为单特异性。7.根据权利要求1的分离的结合部分，其中，结合部分是双特异性而有至少一部分是对肺炎球菌溶血素为特异性。8.根据权利要求1的分离的结合部分，其中，结合部分是多特异性而有至少一部分是对肺炎球菌溶血素。9.根据权利要求1的分离的结合部分，其中，结合区是由人抗体骨架携带。10.根据权利要求1的分离的结合部分，其中，结合区是由人源化抗体骨架携带。11.根据任何之前的权利要求中分离的结合部分，其中所述结合区识别由seqidno27构成的表位。12.根据任何之前的权利要求中分离的结合部分，其中，所述结合区识别由seqidnos28，29，30或31构成的表位。13.根据任何之前的权利要求中分离的结合部分，其中，所述结合区识别由seqidno11确认的肺炎球菌溶血素氨基酸425-436构成的表位。14.根据任何之前的权利要求中分离的结合部分，其中，结合区包含至少一氨基酸序列选自seqidnos3，4，5，6，7，8，9及10或其同源物。15.根据任何之前的权利要求中分离的结合部分，其中，结合区包含至少一氨基酸序列选自seqidnos12，13，14，15，16，17或10或其同源物。16.根据任何之前的权利要求中分离的结合部分，其中，结合区包含一氨基酸序列，该氨基酸序列包含由seqidno10或其同源物确定的序列。17.根据任何之前的权利要求中分离的结合部分，其中结合区包含一氨基酸序列，该氨基酸序列包含由seqidno8或seqidno17或其同源物确定的序列。18.根据任何之前的权利要求中分离的结合部分，其中，结合区包含一氨基酸序列，该氨基酸序列包含由seqidno9或seqidno18或其同源物确定的序列。19.根据任何之前的权利要求中分离的结合部分，其中，结合部分能够结合来自两个或以上的不同的肺炎球菌血清型的肺炎球菌溶血素。20.根据权利要求14-19中任何一个权利要求的分离的结合部分，其中，同源物至少有60％与一个或以上选自seqidnos3，4，5，6，7，8，9，10，12，13，14，15，16，17，18的序列相同，例如至少65％相同，诸如至少70％相同，例如至少75％相同，例如至少80％相同，例如至少85％相同，例如至少90％相同，例如至少95％相同，例如至少98％相同。21.根据权利要求1的分离的结合部分，其中，离解常数少于5×10-9m，例如少于1×10-9m。22.根据任何之前的权利要求中分离的结合部分，其中，结合区是位于vl区。23.根据任何之前的权利要求中分离的结合部分，其中，结合区是位于vh区。24.根据权利要求14-23中任何一个权利要求的分离的结合部分，其中，结合区排列为在结合部分的互补决定区(cdr)。25.根据权利要求3的分离的结合部分，其中，抗体片段是选自fab，fab’，f(ab)2及fv。26.根据任何之前的权利要求中分离的结合部分，包含至少一个第一结合区及一个第二结合区，所述的第一结合区能够特异性地结合肺炎球菌溶血素，及所述的第二结合区是与第一结合区不同。27.根据权利要求25的分离的结合部分，其中，第二结合区能够特异性地结合哺乳动物的蛋白，例如是人蛋白，例如是选自cd64或cd89的蛋白。28.根据权利要求25的分离的结合部分，其中，第二结合区能够特异性地结合哺乳动物的细胞，例如人细胞，例如是选自白细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性细胞及嗜曙红细胞的细胞。29.根据权利要求26的分离的结合部分，其中，第二结合区能够特异性地结合肺炎球菌蛋白。30.根据权利要求28的分离的结合部分，其中，第二结合区能够特异性地结合肺炎球菌表位，而与第一结合区不同。31.根据权利要求25的分离的结合部分，其中，结合部分包含两个结合区。32.根据权利要求30的分离的结合部分，其中，两个结合部分通过一间隔区连接。33.分离的核酸分子，编码至少一部分在权利要求14-23中任何一个权利要求所定义的结合部分。34.载体，包含权利要求32中定义的核酸分子。35.根据权利要求33的载体，包含一核苷酸序列，该核苷酸序列调节由核酸分子编码的抗体的表达。36.宿主细胞，包含权利要求32中定义的核酸分子。37.改造的细胞系，表达权利要求1-32中定义的结合部分。38.探测或诊断个体中与肺炎球菌相关的疾病或病症的方法，该方法包括-从所述个体中提供生物样品；-向所述生物样品中加入如权利要求1-32中任何权利要求所定义的至少一结合部分；-探测结合到所述生物样品上的结合部分，从而探测或诊断疾病或病症。39.试剂盒，包含至少一个在权利要求1-31中任何权利要求所定义的结合部分，所述抗体得以标记。40.药物组合物，包含至少一个在权利要求1-31中任何权利要求所定义的结合部分。41.根据权利要求39的药物组合物，包含至少两个不同的结合部分。42.根据权利要求1-32中任何权利要求所定义的结合部分在制备药物组合物中的应用。43.根据权利要求1-32中任何权利要求所定义的结合部分在制备治疗肺炎球菌感染的药物组合物中的应用。44.肺炎球菌溶血素肽，包括seqidno11的氨基酸1-436，其片段或变异体，由在权利要求1-32中任何权利要求所定义的结合部分识别。45.肺炎球菌溶血素肽，其片段或变异体，包含被seqidno27，28，27，30，31，32，33，34，35或36确定的氨基酸序列。46.疫苗组合物，包含肺炎球菌溶血素肽，其中，肺炎球菌溶血素肽包含由seqidno27，28，29，30，31，32，33，34，35或36或其变异体确定的氨基酸序列。47.根据权利要求46的疫苗，进一步包含佐剂。48.根据权利要求46的疫苗，其中，肺炎球菌溶血素肽包含seqidno11的氨基酸425-436，其片段或变异体，由在权利要求1-32中任何权利要求所定义的结合部分识别。49.根据权利要求46-48的疫苗组合物，其中，肺炎球菌溶血素肽，其片段或变异体由最多100，例如80，60，40，20，15或例如最多12个氨基酸组成。50.根据权利要求46-49的疫苗组合物在预防性治疗肺炎球菌感染中的应用。全文摘要本发明涉及一抗溶血活性的结合部分，其包含至少一结合区可特异性地结合肺炎球菌溶血素，特别是涉及包含至少两个结合区的结合部分，并涉及所述结合部分在诊断方法及治疗中的应用。在优选的实施方案中，结合部分是抗体，例如人抗体，或其片段，该结合部分也可以是双特异性抗体。文档编号c07k14/195gk101061139sq200580036341公开日2007年10月24日申请日期2005年8月22日优先权日2004年8月23日发明者安德斯·波尔·索伦森,托马斯·拉斯·本菲尔德,简斯·戴琳·兰格伦,托马斯·d·肯佩申请人:吉奈斯拓公司