用于具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生产具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的方法，更具体地，涉及通过从 产生肺炎球菌血清型的细菌细胞的发酵液（培养肉汤，culture broth)中除去杂质如蛋白 和核酸生产具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的方法。
【背景技术】
[0002] 肺炎球菌（肺炎链球菌）是属于家族链球菌科的革兰氏阳性菌，属于乳酸菌纲，并 且它会在人类中引起疾病如肺炎、菌血症、中耳炎和脑膜炎。肺炎球菌血清型的细胞具有荚 膜，其是围绕各个细胞的多糖涂膜。该荚膜通过防止抗体附着到细菌细胞上从而干扰吞噬 作用。基于免疫学特性，该细胞已分类为超过90种血清型，据报道其中一些引起侵袭性疾 病。从1996年至2008年间收集的侵袭性链球菌性肺炎识别了总计有37种血清型，和以以 下顺序出现的主要的血清型19f>23f>19a>6a>3>9v>6b占了大多数53. 4%。这些肺炎球菌 血清型的荚膜多糖已经用于生产疫苗如多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗。
[0003] 用于生产多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗的荚膜多糖由生产相应血清型的细菌 细胞的发酵液获得。各种菌株在最佳温度、ph和搅拌下培养，直到其达到最大密度。为获 得并不是细胞质之外分泌的肺炎球菌荚膜多糖，使用裂解剂如脱氧胆酸钠（d0c)进行细胞 裂解。当细胞被裂解时，连同荚膜多糖释放出菌株的各种蛋白和核酸，并且它们必须通过后 培养纯化过程除去。疫苗接种后，为了最小化由任何非抗原物质引起的不良事件的风险，对 于蛋白和核酸含量有严格的规定。例如，在prevnar 7?的情况下，基于干重，每种血清型中 蛋白和核酸分别满足2%至5%或更低以及1 %至2%或更低的规定。
[0004] 国际专利公开号w0 2006/110352公开了一种生产荚膜多糖的方法，包括肺炎链 球菌的培养、细胞裂解，通过将细胞裂解液酸化至小于5. 5的ph蛋白沉淀、不搅拌孵育和离 心和/或过滤。此外，国际专利公开第w0 2008/118752号公开了通过进行细胞裂解液的超 滤和渗滤以及随后通过经由酸化的蛋白沉淀过程生产荚膜多糖的方法。然而，所有这些相 关的生产方法需要通过用ph调节剂酸化的蛋白沉淀过程，这使得整个过程变得复杂并且 还导致荚膜多糖改性并产生有害物质。
【发明内容】
[0005] 技术问题
[0006] 本发明人已经进行了各种研宄以改进生产具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的方 法。令人惊讶地，本发明人发现当在不调节ph的情况下在相同的条件下进行另外的培养 时，通过来自培养的产物（尤其是乳酸等）可以将ph降低至适合蛋白沉淀的范围，即ph 5. 5。也就是说，本发明人发现，通过在没有ph调节的情况下进行另外的培养可以去除通过 用ph调节剂酸化的蛋白沉淀过程，并且随后进行细胞裂解和蛋白沉淀过程。
[0007] 因此，本发明的目的是提供生产具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的改进的方法。
[0008] 技术方案
[0009] 根据本发明的一方面，提供了生产具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的方法，包括 以下步骤：
[0010] (a)培养产生肺炎球菌血清型的细菌细胞，同时将发酵液的ph保持在7. 0至9. 4 的范围；
[0011] (b)在发酵液的吸光度保持恒定至吸光度开始下降之间的时刻终止步骤（a)的培 养；
[0012] (c)在不调节ph的情况下对获得自步骤（b)的发酵液进行另外的培养直到发酵液 的ph达到5. 5或更低的ph ;
[0013] (d)将裂解剂加入获得自由步骤（c)的发酵液以裂解细胞，沉淀蛋白，并除去沉淀 的蛋白和细胞碎片以得到澄清的细胞裂解液；和
[0014] (e)从获得自步骤（d)的裂解液中分离并纯化荚膜多糖。
[0015] 在本发明的生产方法中，肺炎球菌血清型可以是1、2、3、4、5、6a、6b、7f、9n、9v、14、 18c、19a、19f、22f、23f 或 33f。
[0016] 步骤（a)的培养可以在50至150转/分的搅拌下在34至38°c进行。
[0017] 在本发明的实施方式中，可以通过从发酵液的吸光度保持恒定的时刻1至3小时 内终止步骤（a)的培养进行步骤（b)。
[0018] 步骤（c)的另外的培养可以在不调节ph的情况下在34至38°c在50-150转/分 的搅拌下进行。
[0019] 在步骤（d)中使用的裂解剂可以是脱氧胆酸钠。在本发明的另一实施方式中，通 过将裂解剂加入至由步骤（c)获得的发酵液进行步骤（d)以裂解细胞，然后在不搅拌的情 况下在10至20°c将获得的细胞裂解液孵育3至24小时以沉淀蛋白，以及通过离心去除沉 淀的蛋白和细胞碎片。
[0020] 在本发明的又一实施方式中，步骤（e)的分离和纯化可以包括以下步骤：
[0021] (i)使用深层过滤器过滤由步骤（d)获得的裂解液；
[0022] (ii)浓缩由步骤⑴获得的滤液，然后超滤和离心；
[0023] (iii)使获得自步骤（ii)的上清液与阳离子表面活性剂反应，并且随后离心获得 的溶液以生产含有荚膜多糖的粒料或上清液；
[0024] (iv)使获得自步骤（iii)的荚膜多糖与碘化钠反应，然后离心，从而获得上清液。
[0025] (v)将活性炭加入至获得自步骤（iv)的溶液，然后过滤；以及
[0026] (vi)浓缩获得自步骤（v)的滤液，然后超滤和离心，从而获得荚膜多糖。
[0027] 在上述实施方式中，可以使用lookda的膜进行步骤（ii)的浓缩，以及可以使用 30kda的膜进行步骤（vi)的浓缩。此外，在步骤（iii)中使用的阳离子表面活性剂可以是 十六烷基三甲基溴化按，并且十六烷基三甲基溴化按的使用浓度可以是0. 5%至3. 0%。另 外，在步骤（v)中使用的活性炭可以以1%至5% (w/v)的浓度使用。
[0028] 有益效果
[0029] 在根据本发明的生产方法中，未使用用于蛋白沉淀的ph调节剂。即，本发明证实 在不调节ph情况下，生产肺炎球菌血清型的细菌细胞的另外的培养在相同条件且进行时， 通过来自培养的产物（尤其是乳酸等），ph可以降低到适于蛋白沉淀的范围，即，ph为5. 5 或更低。因此，本发明的生产方法不需要使用用于蛋白沉淀的ph调节剂，从而最小化荚膜 多糖的改性和任何有害物质的产生并且简化生产过程。通过本发明的生产方法得到的具有 肺炎球菌血清型的荚膜多糖可以有利地用于生产