多价的糖结合疫苗的制作方法
【专利说明】多价的糖结合疫苗
[0001] 本发明涉及表达内置的多个表位的新型结合抗原和包含其的多价糖结合疫苗和 制剂。此外，本发明涉及这些疫苗特别地用于保护人类群体和特别地用于保护儿科群体 免受下列感染的用途：因肺炎链球菌（s. pneumoniae)、脑膜炎奈瑟菌（n. meningitidis)、 流感嗜血杆菌（h. inf luenzae)、肺炎克雷伯菌（k. pneumoniae)、结核分枝杆菌 (m. tuberculosis)、金黄色葡萄球菌（s. aureus)引起的肺部和全身性感染，或由伤寒沙门 氏菌（s. typhi)、霍乱弧菌（v. cholerae)和大肠杆菌（e. coli)引起的肠道感染。本发明还 涉及用于保护免受白色念珠菌（c. albicans)和大肠杆菌全身性和泌尿生殖感染或用于保 护免受兽医医学中的牛分枝杆菌（m.bovis)感染的新型多价糖结合疫苗。
[0002] 结合疫苗是衡量现今临床免疫学成功的金标准。自九十年代初，用于预防流感嗜 血杆菌、脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌的结合疫苗的问世已经大大改善了西方世界中儿科群 体的生活质量。这样的突出的成就目前因who发起的扩大免疫规划和通过几个国家的预先 市场承诺（amc)在近期实施的国家免疫规划而正扩展至发展中国家。
[0003] 例如，疫苗如"prevnar"（其自2000年起出现于西方市场，先前其为7-价制剂，目 前其为13-价制剂，这两种制剂均含有共价结合至载体蛋白crm197的肺炎链球菌的单一型 特异性多糖（ps))现今由who推荐至世界上所有国家用于空前的免疫接种活动以保护儿科 群体免受肺炎链球菌的全身性感染（侵袭性肺炎球菌病或ipd)，所述感染可最终诱发急性 细菌性脑膜炎。事实上，正因为治疗的时间间隔被减少到从症状开始后的几个小时，此病理 学被广泛记录为具有高死亡率，所以应遵循的合理策略是预防而非治疗疾病。
[0004] 由于显著代表人中肺炎链球菌感染的细菌种的量很多（现今已知的超过90个种 中的多至23个细菌种）并且当疫苗制剂包含几种结合抗原（例如如果包括由who鉴定为药 物抗性的流行病学最重要的血清型时，13或15或更多种，其包括细菌血清型（根据danish 命名法）1、2、3、4、5、6a、6b、6c、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、 22f、23f、33f)时使用结合至蛋白载体的单一型特异性ps的策略需要显著剂量的载体蛋 白。减少整个结合制剂中载体蛋白的量的可能性正成为一个优先的问题。
[0005] 事实上，必须考虑到用流感嗜血杆菌（一种b型ps的型特异性结合物）、脑膜炎 奈瑟菌（a、c、w135和y群ps的4种群特异性结合物）和肺炎链球菌（1、3、4、5、6a、6b、7f、 9v、14、18c、19a、19f、23f型ps的多至13种型特异性结合物）的结合疫苗进行免疫接种用 于预防广谱ipd的儿童将要注射18种结合抗原，其具有载体蛋白的18倍单一型特异性剂 量的相应负荷。此外，考虑到给2岁前的儿童赋予完全保护需要3至4次剂量的疫苗的事 实，该剂量必须乘以3至4倍。将所有考虑在内，注射入儿童的载体蛋白的总量可容易地达 到约0. 20mg的剂量，至少在蛋白crm197的情况下是如此，这显然造成了免疫系统的压力， 然而到目前为止免疫系统似乎良好地耐受这样量的用于赋予宿主辅助t细胞依赖性的蛋 白载体。然而，通过连续升级多价疫苗的制剂如用于预防肺炎链球菌感染的制剂，血清型ps 的量因而载体蛋白的量注定会随时间上升。
[0006] 在这方面，本发明人已发现结合抗原的新类型，其特征在于表达多种糖特异性、预 定和内置的分子构建体，其使用一摩尔（或微摩尔或纳摩尔或皮摩尔，均代表其分数）的蛋 白载体来携带至少3种不同的型（或群）特异性糖抗原的每一种的至少一摩尔（或微摩尔 或纳摩尔或皮摩尔，均代表其分数），因此结合物表达至少总共四种不同的抗原相关血清学 特异性。
[0007] 以这种方式，包含多达18种型特异性结合抗原的疫苗制剂（作为例子）将通过仅 使用目前可获得的单抗原联合制剂中所需的载体蛋白的量的三分之一（或33%)来合成， 从而使得宿主的免疫系统上的免疫原性负荷将显著降低从而更安全。
[0008] 事实上，由于以重复剂量施用的蛋白抗原（例如作为结合实体）的量使得免疫 系统不堪重负而下调，尤其当预先存在的载体蛋白特异性的记忆igg抗体的显著血清滴 度存在于治疗的宿主中时，存在着免疫学公知的被定义为"载体蛋白依赖性免疫抑制和 免疫干扰"的现象oagan r.等人，vaccine 28(34) :5513-5523, 2010)。然而，根据先 前指出哺乳动物针对糖结合抗原的回忆igg免疫应答受限于蛋白-糖表位的杂合连接 区域，其中免疫应答的特异性限于共价连接的糖结构的一些单糖残基的实验工作，本发 明的分子模型导致的蛋白载体剂量的显著减少保证了辅助t依赖性的完全表达（arndt and porro, immunobiology of proteins and peptides, edited by m. z. atassi, plenum press，new york and london，vol. 303, pages 129-148, 1991)〇
[0009] 上文提及的论文研究结合至载体蛋白crm197的肺炎链球菌ps的不同化学策略和 不同mw，用于在使用单官能活化的糖抗原时获得最优的结合物结构；该论文还通过合成的 结合物的分子图谱研宄了结合构建体中用于负责哺乳动物中的辅助t依赖性（通过分析 igg同种型多克隆抗体）的最可能的分子区域。
[0010] 以相同申请人名义的us 4, 711，779公开了三价糖蛋白的分子模型，其在哺乳动 物中表达针对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的免疫原性。该文献涉及分子构建体，其使用 通过在低温度下于化学水解后显现的末端还原基团上引入的接头衍生物共价偶联至载体 蛋白的低mw寡糖；该结合物的特征在于最多3种不同的特异性（针对蛋白crm197,针对6a 型ps，针对c群ps);其使用单官能性的寡糖；所述分子构建体引发针对载体蛋白和针对所 携带的两种糖结构的每一种的血清学特异性。
[0011] 同样以相同申请人名义的us 5, 306, 492公开了寡糖结合疫苗和用于产生所述基 于寡糖的结合疫苗的改进方法。该方法涉及在经由接头分子共价偶联至载体蛋白之前在高 温和在所显现的末端还原基团上活化寡糖半抗原；表达二价特异性的典型结合物（针对蛋 白crm 197和针对型（或群）-ps);其使用单官能性的寡糖；所述分子构建体引发针对载体 蛋白和针对所携带的单一糖结构的血清学特异性。
[0012] 以相同申请人名义的ep 1501542公开了以高产率产生hmw多分散的、交联的、基 于多糖的结合抗原的新方法；表达针对蛋白质破伤风类毒素和针对所携带的型（或群）_ps 的特异性的典型结合物；其使用偶联至多官能蛋白载体的多官能多糖；所述分子构建体引 发针对载体蛋白和针对所携带的单一糖结构的血清学特异性。
[0013]此外，porro m?等人（medecine tropicale, 43:129-132, 1983)首次介绍了脑膜 炎球菌b群寡糖（预先在受控的酸性条件下进行了水解）在其末端还原基团上通过氨和 经由在低温（25-37°c )下的还原胺化的活化化学；这样的具有单官能氨基的寡糖随后被己 二酸的双-琥珀酰亚胺酯活化，并随后结合至载体蛋白crm197的赖氨酸残基的氨基。活 化的寡糖抗原在结合过程中是单官能性的并且结合在没有载体蛋白crm 197的预先活化 的情况下发生。此外，porro m?等人（molecular immunology, 22:907-919(1985))首次 公开了肺炎球菌6a型寡糖（预先在受控的酸性条件下进行了水解）在其末端还原基团上 通过氨和经由还原胺化的活化化学，其论文题为"specific antibodies to diphtheria toxin and type 6a pneumococcal capsular polysaccharide induced by a model of semi-synthetic glycoconjugate antigen"。这样的具有单官能氨基的寡糖随后被己二酸 的双-琥珀酰亚胺酯活化，并随后结合至载体蛋白crm197的赖氨酸残基的氨基。活化的寡 糖抗原在结合过程中并且在没有载体蛋白的预先活化的情况下是单官能性的。
[0014]在之后的一篇文章（molecular immunology, 23 :385_391，（i986))中，相同的 作者表征了两种荚膜寡糖（分别来源于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌）与相同蛋白载体 crm197使用在前述文章中所公开的活化化学和结合化学的两步结合方法。两种活化的寡糖 抗原在结合过程中并且在没有载体蛋白的预先活化的情况下是单官能性的。
[0015] 已观察到在该文章中公开的结合物牵涉不同的端点活化的低mw荚膜寡糖（即肺 炎链球菌6a型ps和脑膜炎奈瑟菌的c群ps)。这样的端点活化的使用提供低的偶联产率从 而导致与所携带的两种寡糖结构的最大量不成比例的巨大量的载体蛋白（相对于4.8yg 的6a ps和3 y g的c型ps，约31. 2 y g的crm197,参见上文引用的1986年的文献的第387 页左栏）。
[0016]最后，在之后的一篇文献（porro m?由 r. bell 和 g. torrigiani (world health organization)编辑，第 279-306 页；john wiley&sons publishers, new york 1987)中， 本发明人概述了上文对于包含蛋白载体和最多两种不同的糖结构的结合抗原所引用的概 念和技术方法。
[0017] 在上述现有技术的发展中，本发明的基本分子构建体的优选（非限制性）实施方 案包括多价的、优选四价的半合成糖蛋白，其特征在于内置的多个表位并且将其辅助t依 赖性免疫原性特异性"体内"表达至蛋白crm197以及所携带的3种型特异性ps，例如肺炎链 球菌的 ps。作为例子，肺炎链球菌的 1、2、3、4、5、6a、6b、6c、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、 15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、33f 型 ps 的任何三元组，例如由 3、6a、7f 型 ps 组成的 三元组可结合至载体蛋白。作为例子，术语"四价"是指载体蛋白抗原（自身用作抗原而不 是仅仅作为载体）加上三种携带的ps抗原。
[0018] 因此，所述新的新型分子构建体诱导针对载体蛋白和针对所携带的三种糖结构的 每一种的血清学特异性。
[0019] 此半合成的四价抗原可以被认为是新一代表达多种特异性的结合抗原的新的新 型前体，其用于获得具有针对多种细菌病原体的始终广谱的保护的疫苗同时显著减少载体 蛋白的量，以获得在下列方面的合理改善：
[0020] a)生产疫苗的费用；
[0021] b)其在允许合成具有三种（或更多）ps抗原的糖蛋白（特征还在于高mw)的偶联 产率的改善方面上的生产效率；
[0022] c)它们在从血清学观点上通过使用本申请中记载的特异性抑制-elisa测定对共 价连接的ps的量的定量测定方面的生产准确性，用于准确地定量存在于所公开的分子构 建体中的多种糖抗原，其基于免疫化学而非所引用的现有技术的化学定量（参见porro等 人，1986)，尤其是在其中高度显著的相似性存在于种特异性糖结构之间的各种情况下；
[0023] d)其与施加于目标群体的免疫系统的蛋白剂量的较低量相关的安全性。事实上， 所述蛋白剂量是存在于porro等人，1986的文献的具有两种ps的crm197结合物中的蛋白 剂量的约30 % (前述2 y g蛋白/三元组/剂量的整个15-价制剂的剂量中的约10 y g的蛋 白）。基于文献中报道的可用的化学计量的其中免疫接种剂量包括至少31. 2 y g的crm197 的这样的量，该蛋白剂量的减少对于本领域技术人员是不可预测的；因此，对于包含13或 15种结合抗原的多价组合物，即使假定制备的可能性，根据先前的化学过程，本发明详述的 多种四价分子模型，制剂中的蛋白crm197的量会是31. 2x 15/3 = 156. 0 y g，相对于本发明 的10 y g的多价结合物；以及最后
[0024] e)这样的结合疫苗的公共实用性。
[0025] 本发明在临床免疫学和疫苗学领域中开辟了新的途径。实际上，所公开的分子构 建体的内置的多种抗原性（特异于不同的细菌抗原）在多药理学的创新领域中实际上相当 于优先设计用于同时到达具有药理学相关性的多个受体的药物的合成，因此允许减少以联 合形式施用的药物的数量（besnard j.等人，nature, 492:215-220, 2012) 〇
[0026] 因此，本发明的一个目的是由基本单元组成的抗原性多价分子构建体，所述基本 单元包括共价连接至最少三种具有不同血清学特异性的糖结构的辅助t依赖性载体蛋白， 其中每个糖结构包含至少一个重复基本抗原表位，所述表位其由最少5至12个单糖残基， 优选最少8至12个单糖残基组成，如通过分子量测定和nmr光谱所评估的（取决于同源 或异源序列等价于不同数量的基本重复单元），所述重复基本抗原表位通过测定其各自在 抑制其同源多糖-抗体参照系统中的mic 5(i值由与型特异性或群特异性多克隆或单克隆抗 体的反应性来评价。根据本发明，术语"糖结构"意欲包含寡糖（天然的或合成的）或多糖 (例如荚膜多糖）。
[0027] 根据本发明的抗原性多价分子构建体的t辅助依赖性载体蛋白共价连接至最少 三种（例如三或四或五种）具有不同血清学特异性的糖结构直至参与偶联反应的载体蛋白 结构中存在的结构氨基酸（主要是lys但还可为例如具有arg和hys的基本结构的氨基 酸）的亲核氨基的反应性的限制。
[0028] 根据本发明的优选实施方案，共价连接至最少三种具有不同血清学特异性的不同 糖结构的辅助-t依赖性载体蛋白选自：天然白喉突变蛋白crm 197(prf 1007216a)，白喉 类毒素（cae11230. 1的同源毒素），破伤风类毒素（id no. aak72964. 2的同源毒素），来自 流感嗜血杆菌（haemophilus influenzae)的蛋白质d(aaa24998.1);肺炎球菌表面蛋白 (pspa embl cbw33751. 1 和 pspc embl acf56456. 1);肺炎球菌毒素（肺炎球菌溶血素 embl acf56060.1)或其变体和衍生物。特别地，当采用破伤风类毒素时，优选采用通过己二酸二 酰肼间隔剂化学衍生的类毒素（破伤风类毒素-adh)。
[0029] 根据本发明的最优选实施方案，载体蛋白质是天然白喉突变蛋白crm 197。
[0030]这种蛋白首先由 uchida 和 pappenheimer (uchida t.等人，工13;[01. chem. 248, 3838-3844, 1973)在七十年代中期报道，其可能用作针对白喉毒素的新型免疫原 (如与白喉类毒素免疫原性相关）的用途已由本申请人报道（porro m.等人，j. infect. dis.，142 (5)，716-724, 1980)。此后，本申请人使用crm 197作为理想的辅助-t依赖性载 体蛋白用于糖抗原，这在理解了后一组抗原在牵涉免疫系统的成熟的特定年龄（从约2个 月到约2岁的年龄）的人受试者中的特殊免疫原性特征的原因后发生。
[0031] 蛋白crm 197包含535个氨基酸的序列，正如白喉毒素（giannini g.等 人，nucl. acid res.，12,4063-4069, 1984)，但在位置52的氨基酸上显示点突变，其中 glu取代gly。其抗原性已被报道为主要涉及该序列的四个区域，当使用单克隆抗体时， 即为 aa 序列 1-156,157-193, 293-345 & 465-535(zuckerd.andmurphyj.r.，mol. immunol. 21，785-793, 1984)。该蛋白质的特征还在于39个赖氨酸残基和一个氨基末端基 团，从而总共40个反应性氨基，其可目的性地用于牵涉各种结合策略的化学反应。
[0032] 本发明的结合物的载体蛋白crm 197通常使用白喉杆菌（c. diphtheriae) c7(m97)t<)x_的克隆来制备，但它也可以通过除其它以外荧光假单胞菌（p. fluorescens) 的克隆获得。
[0033] 根据本发明的抗原性多价分子构建体的优选实施方案，所携带的糖结构选自但不 限于：肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae)的 ps (1,2