专利名称：多糖结合疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及疫苗领域，更具体而言，本发明涉及多糖结合疫苗及其制备方法。
背景技术：
细菌的荚膜多糖是一种重要的保护性抗原。用化学方法纯化的细菌荚膜多糖组分疫苗来预防传染病，是疫苗发展史上的重要举措之一，其中已在全世界范围内广泛应用的多糖疫苗有流行性脑膜炎球菌的a、c、y和w135等4价多糖疫苗，以及肺炎双球菌23价多糖疫苗。但多糖疫苗存在很大的局限性，在2岁以下婴幼儿中的免疫原性差，不能诱导有效地免疫保护。用细菌的多糖(pq与蛋白载体通过化学方法制备的疫苗，称之为结合疫苗 (conjugate vaccine)。goebel和avery早于19 年就首次成功地用化学方法将肺炎球菌的第3型荚膜多糖共价结合至蛋白载体上去制备成多糖-蛋白结合疫苗。这种具有胸腺依赖性(t-cbpendent，td)的蛋白载体可将胸腺非依赖性(t-incbpendent，!！)的多糖抗原转变成胸腺依赖性的抗原，从而启动t辅助淋巴细胞产生一系列的免疫增强效应。自第一个多糖结合疫苗_b型嗜血流感杆菌结合疫苗(hib)于1987年经美国食品和药物管理署(fda)批准投入临床应用以来，各种多糖蛋白结合疫苗的研究发展迅速，已成为当今疫苗研究领域的热点之一。目前的结合疫苗主要有流感嗜血杆菌结合疫苗、肺炎球菌结合疫苗、脑膜炎球菌结合疫苗、痢疾杆菌结合疫苗、伤寒vi结合疫苗、乙型溶血性链球菌结合疫苗等。大多数的多糖结合疫苗主要以破伤风类毒素(tt)和白喉内毒素的脱毒突变体 (crm197)作为载体，种类比较单一，会造成多糖抗体应答低下的现象，这是由于结合疫苗中相同的载体蛋白只能与同一辅助性t细胞(th)竞争性结合，从而使每种多糖抗原最终激活的b细胞数量减少，多糖特异性的抗体水平下降。载体的多样化可以使上述问题得到改善， 其原因可能是用不同载体蛋白结合同一种多糖时激活的th细胞克隆数要多于单一载体蛋白的th细胞克隆数，可产生更高水平的特异性抗体。同时，结合疫苗可同时产生针对多糖和蛋白载体的免疫应答，为多联疫苗的开发提供了思路。结合疫苗还具有载体蛋白效应，在接种结合疫苗时，载体蛋白能产生类似佐剂的作用。因此，对载体蛋白的研究和开发势在必行。许多研究者致力于开发粘膜投递型疫苗，这种投递途径与大多数病原体的自然感染途径相同，而且粘膜投递途径简单、安全，避免了注射疫苗所需的严格标准，有利于开展大规模人群的免疫接种。许多研究表明，相对于在自然感染中通过粘膜途径感染的一些病原体而言，通过粘膜途径对机体进行疫苗免疫，机体所产生的免疫保护是最有效的。它既能产生机体粘膜系统的局部免疫保护反应，又能产生全身性的免疫反应来预防疾病的发生。 因此，开发粘膜投递型疫苗具有一定的科学性和必要性。有研究表明，以tt为载体蛋白的c群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗通过滴鼻免疫小鼠，诱发了较好的粘膜免疫应答。有的研究者将不可分型流感嗜血杆菌(nthi)来源的寡糖类物质与tt结合后，滴鼻免疫小鼠，结果产生了较好的体液免疫和细胞免疫应答。因此，tt可以作为粘膜投递型多糖蛋白结合疫苗的蛋白载体。大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位(ltb)为代表的一些病原菌蛋白成分是近年来研究较多的一类粘膜佐剂。研究表明，流感病毒亚单位抗原或白喉类毒素(dt)与ltb形成疫苗，共同鼻内免疫小鼠后，血清中产生了高滴度的特异性igg抗体，口腔、阴道分泌物中和肺部表面产生了中等水平的粘膜iga抗体。目前研究的c群脑膜炎球菌多糖结合物主要以tt或crm197为载体，大肠杆菌不耐热肠毒素lt-k63只是作为佐剂来增强结合物的免疫原性。目前尚未见到以此类蛋白为载体蛋白的细菌多糖结合物。因此，目前要研究同时具有保护性抗原和佐剂功能的多糖载体蛋白、进而改善和延伸现有多糖结合疫苗的功能正日益成为热点。以这类蛋白为载体的多糖蛋白结合疫苗具有重要的实际应用意义和广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种多糖结合疫苗。本发明的目的还在于提供该多糖结合疫苗的制备方法。为了实现本发明的目的，本发明提供一种多糖结合疫苗，包含细菌多糖与载体蛋白的化学偶联物，其中所述载体蛋白为细菌粘膜侵袭相关蛋白。优选地，所述载体蛋白选自大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位(ltb)、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白al (fspal)、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白a2(fspa2)、肺炎球菌表面蛋白(pspa)和肺炎球菌表面黏附素(psaa)。优选地，所述细菌多糖选自脑膜炎球菌多糖、嗜血流感杆菌多糖和肺炎球菌多糖。优选地，所述细菌多糖为脑膜炎球菌多糖，并且所述载体蛋白为大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位。本发明的疫苗可以是本发明方法直接制备得到的液体制剂的形式，也可以是将该液体通过浓缩得到的浓缩液形式，或是通过干燥(例如)冷冻干燥后得到的冻干粉剂形式。优选地，所述多糖结合疫苗为液体制剂，该液体制剂中还包含有未与所述载体蛋白结合的游离细菌多糖，并且在所述液体制剂中，总细菌多糖的含量为30-800μ g/ml，载体蛋白的含量为30-900μ g/ml，以及总细菌多糖和载体蛋白之间的重量比为0. 3_3。优选地，在本发明所述疫苗中，未与所述载体蛋白结合的游离细菌多糖的含量低于 30%。优选地，所述多糖结合疫苗的液体制剂形式是通过注射或粘膜投递的方式来施用的。本发明还提供一种多糖结合疫苗的制备方法，该方法包括1)提供细菌多糖；2)提供载体蛋白；3)使所述细菌多糖和所述载体蛋白化学偶联；其中，所述载体蛋白为细菌粘膜侵袭相关蛋白。优选地，所述载体蛋白选自大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位(ltb)、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白al (fspal)、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白a2(fspa2)、肺炎球菌表面蛋白(pspa)和肺炎球菌表面黏附素(psaa)。
优选地，所述细菌多糖选自脑膜炎球菌多糖、嗜血流感杆菌多糖和肺炎球菌多糖。在本发明中，可利用基因工程方法体外重组表达载体蛋白，包括(例如)大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位(ltb)、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白al (fspal)、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白a2(fspa2)、肺炎球菌表面蛋白(pspa)和肺炎球菌表面黏附素o^saa)，并将载体蛋白与多糖抗原进行化学偶联制备成多糖蛋白偶联物。本发明人发现，这种偶联物可以作为预防多糖和蛋白所对应的病原体的疫苗。由于这些载体蛋白分别是大肠杆菌、空肠弯曲菌和肺炎球菌的保护性抗原成分，它既是一种保护性抗原又是较强的粘膜佐剂，因此，如果将这些蛋白作为多糖结合疫苗的载体蛋白，可以使传统的多糖结合疫苗改型为粘膜投递型疫苗。而且载体多样化可以解决多价多糖结合疫苗中载体单一造成的抗体应答低下现象和载体蛋白的毒性蓄积现象。不仅如此，以这些蛋白为载体的多糖结合疫苗提供了针对产毒性大肠杆菌、空肠弯曲菌以及肺炎球菌的交叉免疫保护反应。
图1为重组质粒pet42b ltb构建示意图(ltb =ltb基因；ndei =ndei酶切位点； avrii =avrii 酶切位点)；图2为重组质粒pet30a fspal构建示意图(fspal :fspal基因；ndei =ndei酶切位点；sac i =saci酶切位点)；图3为重组质粒pet30a pspa构建示意图(pspa :pspa基因；ndei =ndei酶切位点；sac i =saci酶切位点)。
具体实施例方式以下结合附图通过具体实施方式
的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明所使用的培养基可通过如下方法制备lb液体培养基胰化蛋白胨(bacto-tryptone，oxoid公司)10g，酵母提取物 (bacto-yeast extract, 0x0id 公司)5g, nacl 10g，加蒸馏水溶解，定容至 1000ml，高压灭菌(0. 12mpa，115°c，20分钟)后4°c保存备用。lb液体培养基(kana )胰化蛋白胨(bacto-tryptone，0x0id公司)10g，酵母提取物(bacto-yeast extract，0x0id公司)5g，nacl 10g，加蒸馏水溶解，定容至1000ml，高压灭菌(0. 12mpa，115°c，20分钟)，等到温度降到50°c时，加入卡那霉素(kana)至终浓度为 30ug/ml，4°c保存备用。lb固体培养基(kana )在100ml上述lb液体培养基中加入1. 5g琼脂，高压灭菌 (0. 12mpa, 115°c，20分钟)，等到温度降到50°c时，加入卡那霉素(kana)至终浓度为30ug/ ml，铺板，4°c保存备用。实施例1下面以大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位(ltb)与c群流行性脑膜炎球菌多糖 (gcmp)的结合为例，来对本发明进行详细说明。(一 )、重组大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位(rltb)的克隆和表达1)ltb基因的合成与表达载体的构建ltb基因序列选自于genbank，序列号为gi :157021177。按照大肠杆菌密码子使用频率表(参考文献:maloy, s.，v. stewart, andr. taylor. 1996. genetic analysis of pathogenic bacteria. cold springharbor laboratory press, ny. ) ixitiitl^^i, ^ε ψβ] c 末端加上6个组氨酸标签和终止密码子，然后在序列两端分别加上ndel、avrii酶切位点。人工合成上述ltb基因，然后用ndei、avrii双酶切ltb和pet42b (购自novagen)， 再将双酶切ltb后的目的片段和pet42b载体连接，构建成重组质粒pet42b ltb，如图1所示。全基因合成及上述构建工作由上海捷瑞生物工程有限公司完成。2)重组载体的酶切鉴定将步骤1)获得的重组质粒pet42b ltb转化到大肠杆菌dh5 α中，并将转化子接种到lb固体培养基(kana )平板上，从中挑取生长状态良好的菌落，接于lb液体培养基 (kana )中，于37°c摇床、230rpm过夜培养。提取质粒，进行ndei、avrii双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分析证明，在相应的位置上有ltb目的基因片段和pet42b载体片段，条带大小与
预期一致。3)目的蛋白ltb的表达将步骤1)获得的重组质粒pei^^b ltb转化至大肠杆菌bl21中，在237rpm、37°c 培养箱中培养至od值为1. o时，加入终浓度为imm的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，诱导表达2-4小时(参考文献《分子克隆试验指南》第三版(上、下册)(美)j.萨姆布鲁克，黄培堂，科学出版社，2002)。经sds-page检测(参考文献《分子克隆试验指南》，出处同上)和flfestern blot 鉴定(参考文献《分子克隆试验指南》，出处同上)证明，上述大肠杆菌bl21的表达产物为 ltb，且可与ltb的单克隆抗体(购自hytest公司)特异性结合，与预期结果相符。(二)、rltb 的纯化将上述诱导表达后的大肠杆菌bl21离心(5000rpm，10分钟)，弃上清，将菌体用 20mm、ph7. 0的磷酸缓冲液(磷酸二氢钠_磷酸氢二钠)清洗一次，再用上述20mm、ph7. 0 的磷酸缓冲液重悬，用超声破碎仪破碎。破碎完全后离心(11000rpm，40分钟)，收集上清， 用cm-ff阳离子交换柱(购自ge healthy)纯化，收集在洗脱液为0. 17mol/l nacl时的洗脱峰，得到纯化后的本发明目的蛋白rltb。(三)、rltb与gcmp的化学偶联将上述纯化所得蛋白rltb在4°c下透析48小时后，过滤除菌，于4°c保存备用。取 2. 5ml gcmp (天坛生物制品股份有限公司馈赠)(约iomg)，加入等质量的cnbr，搅拌进行反应，并用0. im naoh维持ph10. 8，在高ph条件下，cnbr与多糖糖链上的羟基反应生成氰酸酯。在上述反应进行10分钟后，加入己二酰胼(adh) 70mg,用0. im naoh维持ph8. 5，于4°c 反应过夜，使adh与氰酸酯反应形成异脲键，生成gcmp-adh酰胼类衍生物。然后将反应混合物装入透析袋，于0. 2m nacl中透析48小时，除去未反应的cnbr、adh或反应中间物。然后用盐酸调节透析物的ph值至5. 7，加入上述制得的载体蛋白rltb，使透析物(多糖)与rltb 的质量相等，再加入终浓度0. im edac (碳二亚胺)，用盐酸维持ph5.7，于2-8°c搅拌透析2 天，使载体蛋白的羧基与gcmp-adh酰胼类衍生物的氨基发生缩合反应，生成gcmp-adh-载体蛋白，然后收取透析物。
在上述氰酸酯与adh反应透析4 后，用tnbs比色法检测衍生物中adh的含量， 可以反映多糖平均修饰度，检测结果为0. 8-1. 5% (重量比)。(四)、rltb与gcmp的结合物的纯化将步骤(三)得到的反应产物于iokd超滤管(millipore)中超滤浓缩，再用 0. 45 μ m滤膜过滤，用kphorose 4ff凝胶柱纯化，使用0. 2mnacl为洗脱剂，收集外水体积处的洗脱峰，得到本发明gcmp-rltb结合物溶液。对gcmp-rltb结合物进行定性检测和定量检测，其中根据在分子筛外水体积处^onm波长处有、无吸收峰来对gcmp-rltb结合物进行定性检测，如有吸收峰则表明载体蛋白与多糖生成了结合物，反之则说明没有多糖蛋白结合物生成。对结合物中多糖和蛋白质含量的检测采用《中华人民共和国药典》第三部oolo 年版，国家药典委员会编，中国医药科技出版社)所记载的方法。所述定性检测和定量检测的结果为在分子筛外水体积处280nm波长处有吸收峰，蛋白含量j46. 5 μ g/ml，总多糖含量640. lyg/ml，游离多糖含量15. lyg/ml，多糖/蛋白(重量比):2. 5。(五)、gcmp-rltb结合物的免疫效果1.试验药品通过上述方法制备的gcmp-rltb结合物，以及gcmp-tt (北京生物制品研究所细菌研究室馈赠)、gamp-tt gcmp-tt(北京生物制品研究所细菌研究室馈赠)、 gcmp (天坛生物制品股份有限公司馈赠)，并配制成具有试验所需总多糖含量的液体制剂。2.试验动物balb/c小鼠，24只，雌性，6周龄，体重18_20g，购自天坛生物公司， 在天坛生物公司动物房饲养。3.动物分组将balb/c小鼠随机每6只分为一组。4.免疫方式滴鼻组34 μ 1/只，含总多糖为10 μ g或20ug，从小鼠鼻孔缓慢滴入，注意勿流入口腔及肺；腹腔注射组100 μ 1/只，含总多糖10 μ g或20ug ；一共免疫4次，第0、14、21天免疫，第三次免疫后1周即第21天用含2%皂苷 pbs (ph7. 4)冲洗小鼠阴道/ 口腔/肺/小肠并收集冲洗液后，在小鼠眼球处取血约500μ 1 作检测。末次免疫后1周即第观天以同样的方法收集冲洗液后，摘眼球取血拉颈处死小鼠。5.检测方法小鼠阴道/ 口腔/肺/小肠冲洗物中抗多糖iga的elisa测定以每孔100 μ 1稀释液(含总多糖 ο μ g)包被96孔酶标板4°c过夜后，37°c封闭3h，以1 32起始稀释小鼠阴道/ 口腔/肺/小肠冲洗液后，再进行倍比稀释，以每孔100 μ 1加入孔中，置于37°c培养箱ih;加入以1 2000稀释的羊抗鼠iga 100 μ 1/孔，置于37°c培养箱ih后显色并用酶标仪读数。小鼠血液中抗多糖igg的elisa测定以每孔100 μ 1稀释液(含总多糖ioyg) 包被酶标板4°c过夜后，37°c封闭池，以1 100起始稀释离心后的血清，再进行倍比稀释， 以每孔100 μ 1加入孔中，置于37°c ih;加入以1 5000稀释的羊抗鼠igg 100 μ 1/孔，置于37°c培养箱ih后显色并用酶标仪读数。小鼠小肠/肺冲洗物中抗ltb iga的elisa测定将ltb蛋白(购自sigma公司) 以10ug/ml的浓度包被酶标板(每孔100μ 1)4°c过夜后，37°c封闭3h，以1 10起倍比稀释小肠/肺冲洗物，以每孔100μ1加入孔中，37°c孵育ih;加入以1 2000稀释的羊抗鼠iga，置于37°c培养箱ih后显色并用酶标仪读数。小鼠血液中抗ltb igg的elisa测定将ltb蛋白(购自sigma公司)以ioug/ ml的浓度包被酶标板(每孔100μ 1)4°c过夜后，37°c封闭3h，以1 40起倍比稀释血清， 以每孔100μ 1加入孔中，置于37°c ih ；加入以1 5000稀释的羊抗鼠igg，置于37°c培养箱ih后显色并用酶标仪读数。6.试验结果a. gcmp特异丨牛血清和粘腊免,疮应答水平试验1.滴鼻免疫时gcmp-rltb特异性血清和粘膜免疫应答水平以及与gcmp-tt 免疫应答水平的比较试验结果见表1。从表1中可以看出，通过使用含总多糖为ioyg或20ug的 gcmp-rltb滴鼻免疫小鼠，在第四次免疫后1周即观天，小鼠阴道冲洗物中多糖抗体滴度都明显高于第三次免疫后1周即第21天冲洗物中多糖抗体滴度(p < 0. 01)；血液中多糖抗体滴度也都明显高于第三次免疫后1周血液中抗体滴度(p < 0. 01)；并且在第四次免疫后 1周即观天，小鼠口腔冲洗物和肺冲洗物中也都表现出一定量的多糖抗体滴度。此外，gcmp-rltb滴鼻组和gcmp-tt滴鼻组相比，小鼠阴道/ 口腔/肺冲洗物中的抗多糖iga和血液中的抗多糖igg的抗体滴度都有显著性差异(p <0.05)。此结果说明 ltb和tt两种载体蛋白在和gcmp的偶联效果上，前者优于后者。表lgcmp-rltb结合物、gcmp-tt的免疫效果评价数据(gmt为几何均数)
权利要求
1.一种多糖结合疫苗，其特征在于，包含细菌多糖与载体蛋白的化学偶联物，其中所述载体蛋白为细菌粘膜侵袭相关蛋白。
2.根据权利要求1所述的多糖结合疫苗，其特征在于，所述载体蛋白选自大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白al、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白a2、肺炎球菌表面蛋白和肺炎球菌表面黏附素。
3.根据权利要求2所述的多糖结合疫苗，其特征在于，所述细菌多糖选自脑膜炎球菌多糖、嗜血流感杆菌多糖和肺炎球菌多糖。
4.根据权利要求3所述的多糖结合疫苗，其特征在于，所述细菌多糖为脑膜炎球菌多糖，并且所述载体蛋白为大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的多糖结合疫苗，其特征在于，所述多糖结合疫苗为液体制剂，该液体制剂中还包含有未与所述载体蛋白结合的游离细菌多糖，并且在所述液体制剂中，总细菌多糖的含量为30-800 μ g/ml，载体蛋白的含量为30-900 μ g/ml，以及总细菌多糖和载体蛋白之间的重量比为0. 3-3。
6.根据权利要求5所述的多糖结合疫苗，其特征在于，在所述疫苗中，所述的未与所述载体蛋白结合的游离细菌多糖的含量低于30%。
7.根据权利要求1所述的多糖结合疫苗，其特征在于，所述多糖结合疫苗是通过注射或粘膜投递的方式来施用的。
8.一种多糖结合疫苗的制备方法，该方法包括1)提供细菌多糖；2)提供载体蛋白；和3)使所述细菌多糖和所述载体蛋白化学偶联；其中，所述载体蛋白为细菌粘膜侵袭相关蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述载体蛋白选自大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白al、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白a2、肺炎球菌表面蛋白和肺炎球菌表面黏附素；所述细菌多糖选白脑膜炎球菌多糖、嗜血流感杆菌多糖和肺炎链球菌多糖。
全文摘要
本发明涉及一种多糖结合疫苗，包含细菌多糖与载体蛋白的化学偶联物，所述载体蛋白为细菌粘膜侵袭相关蛋白，如大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白a1、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白a2、肺炎球菌表面蛋白、肺炎球菌表面黏附素。本发明还涉及该多糖结合疫苗的制备方法。本发明所述的多糖结合疫苗可以在不添加其它任何外源性蛋白的前提下，实现多糖结合疫苗的粘膜投递，这种免疫途径将使疫苗的使用更加高效、便捷和安全。
文档编号a61k47/48gk102462839sq20101054839
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者卫江波, 唐玉龙, 张学峰, 张靖, 李启明, 陈实, 靳玉琴, 马智静 申请人:北京生物制品研究所