一种以异型双功能试剂为连接桥的脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供了一种新型的制备脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖结合疫苗的结合技术； 基于此结合技术，制备出了脑膜炎荚膜多糖结合疫苗，可用于脑脊髓膜炎等重要疾病的免 疫预防，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 流行性脑膜炎是由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜发炎的疫症，至今仍未得到有效 控制。脑膜炎奈瑟氏球菌主要经由咳嗽，喷嚏或接吻传播，由鼻咽部侵入血循环，最后局限 于脑膜和脊髓膜，形成化脓性脑脊髓膜病变。常见的病征包括发高烧、剧烈头痛、后颈僵硬； 亦会有嗜睡、呕吐、惧光或皮瘆等情况出现。此病可引致脑部受损甚至死亡，病死率较高，维 持在5-10%之间，遍见于世界各国，呈散发或大、小流行，以儿童发病率为高。
[0003] 使用抗生素可以有效治疗流行性脑膜炎。在未使用抗生素以前该病的病死率在 70%左右，使用抗生素治疗以来病死率降低至5%~15%，甚至低于5%。然而，由于抗生素 的过度使用，细菌的耐药菌株数量和种类迅速地增长，导致治疗更加困难。这引起了医学界 的广泛忧虑，并增加了病人的治疗成本和难度。为了应对不断恶劣化的抗药性病菌对人类 的威胁，世界各地的医生开始严格地控制使用抗生素，同时扩大疫苗的接种范围。因此，研 制与开发预防流行性脑膜炎的疫苗具有十分重大的意义。
[0004] 脑膜炎奈瑟氏菌根据其荚膜多糖的特异性可将脑膜炎球菌分成a、b、c、d、29e、h、 i、k、l、w135、x、y、z十三个血清群，所有血清群的细菌均可致病，但a、c、w 135和y毒力最强， 上述4个血清群占病例数的95%以上，是引起脑膜炎流行最常见的菌株。荚膜多糖能够屏 蔽细菌细胞表面功能成分，使其免于被宿主免疫系统识别，防止补体系统被细菌表面的蛋 白激活和免疫细胞吞噬。如果细菌被免疫细胞吞噬，荚膜多糖也能够避免细菌被杀灭。荚 膜多糖是脑膜奈瑟氏菌的主要抗原成分之一，作为疫苗对较大的儿童有一定的保护力。然 而，荚膜多糖对2岁以下婴幼儿、老年人以及b细胞免疫缺陷的人群免疫效果差，接种剂不 能达到抗体保护水平，且抗体很快消失。该多糖疫苗与其它多糖疫苗一样，属t细胞非依赖 性抗原，具有年龄相关的免疫原性，且不诱生t细胞依赖性的加强应答。通过将多糖与某种 蛋白质共价结合，可使多糖转化成t细胞依赖性抗原，从而刺激婴幼儿的t细胞依赖性抗体 的合成，并可产生加强应答，同时还能提高免疫球蛋白（igg)的抗体比例。这种多糖结合疫 苗不仅能够保护婴幼儿（2岁以下儿童），还能够大大地增强抵抗力差的病人对细菌感染的 抵抗力，因此具有十分广阔的应用前景。
[0005] 细菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗最早出现在20世纪30年代，goebel和avery将 3型肺炎球菌多糖连接到马血清球蛋白上，产生的偶联物能在动物身上产生多糖专一的抗 体，同时提供相应的免疫保护。1987年，世界上第一个多糖蛋白结合疫苗，b型流感嗜血杆 菌（hib)多糖-破伤风类毒素（tt)结合疫苗被美国fda批准进入市场。默克公司、辉瑞公 司和诺华公司相继开发了 hib多糖-破伤风类毒素结合疫苗和流行性脑膜炎多糖-破伤风 类毒素结合疫苗，并成功上市。
[0006] 中国专利（zl 02159032. x)公开了一种多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，也是目 前制备多糖结合疫苗最常使用的技术之一。在该技术中，以己二酸二酰肼（adh)作为连接 剂结合多糖与蛋白。这种结合方式首先需要将多糖经溴化氰活化，即在碱性条件下用溴化 氰作用于多糖分子上的羟基，形成氰酸酯，然后与adh反应；氰酸酯中的一个碳氧键断裂， 与adh-端的氨基发生加成反应，从而将酯酰肼（ah)基团导入多糖分子，形成多糖-ah衍 生物；多糖-ah衍生物在碳二亚胺（edac)的介导下与载体蛋白形成稳定的结合物。这样的 结合方式可减少多糖与载体蛋白结合的空间位阻，保留了多糖的抗原表位，同时避免了多 糖本身的溶解性，减少多糖与抗血清反应的副作用。
[0007] 然而，上述传统的多糖-蛋白结合技术存在着以下不足之处：（1)多糖-ah衍生物 会继续与溴化氰活化的多糖反应，形成多糖的自身聚合物，降低了多糖-蛋白的结合效率； (2)edac在介导adh衍化多糖与载体蛋白结合的同时，容易引起多糖与载体蛋白的自身交 联，从而降低多糖-蛋白的结合效率；(3)多糖和载体蛋白均为大型生物分子，中间靠仅有 6个碳原子长度的adh相连，多糖和蛋白质的结构势必会相互影响，使得多糖的一些重要抗 原表位易被蛋白质所屏蔽，进而降低多糖的免疫原性。因此，多糖-蛋白结合疫苗的免疫原 性和抗体持效性仍有待进一步提高，如多糖结合疫苗需要免疫三次才能产生免疫效果。这 些不足之处限制了多糖结合疫苗的进一步发展。
[0008] 聚乙二醇（peg)是一种安全的、良好水溶性、无免疫原性、无毒的聚合物，并被美 国fda批准在人体使用。peg作为一种修饰剂已在开发蛋白质药物和运载药物的脂质体方 面获得广泛应用，并取得良好的效果。2006年，singh等（vaccine, 2006, 24:4161-4166)发 现在包埋hiv-i的gp41表位的脂质体分子上引入peg可增强疫苗的免疫保护效果。据推 测是由于peg分子能在脂质体周围形成水化层，导致免疫细胞吞噬作用下降，从而增强了 疫苗的免疫持效性；同时，peg分子还增加了抗体中和抗原的难度，从而增强了抗体产生强 度。因此，将peg分子作为连接桥来制备多糖-蛋白结合疫苗，预计能提高结合疫苗的免疫 原性和抗体持效性。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种以异型双功能试剂为连接桥来制备多糖结合疫苗的技术，制备 出了脑膜炎荚膜多糖结合疫苗。
[0010] 本发明的另一个目的还在于通过使用peg作为多糖和蛋白之间的连接桥，进一步 提高多糖结合疫苗的免疫原性和抗原持效性。
[0011] 本发明的脑膜炎荚膜多糖结合疫苗，其中的荚膜多糖为a群、b群、c群、w135群或 y群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖。
[0012] 本发明的脑膜炎荚膜多糖结合疫苗，其中的蛋白载体为破伤风类毒素、crm197、白 喉类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌lt、大肠杆菌st、外毒素a、外膜复合物c、孔蛋白、转铁 蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白a、肺炎球菌粘附素蛋白质、卵清蛋白、 牛血清白蛋白或结核菌素纯化蛋白衍生物等。
[0013] 其中，所述的荚膜多糖和载体蛋白的质量比为（0.2~3): 1，以1:1为优。
[0014] 本发明涉及多糖结合疫苗的制备工艺，包括以下步骤：
[0015] 1)多糖的活化
[0016] 取iomg多糖溶于生理盐水中，使其终浓度为5mg/ml。然后，加入溴化氰活化 0. 5-1. 5小时，溴化氰终浓度为5 y g/ml。溴化氰活化期间，用0. 5m氢氧化钠维持溶液ph值 为10. 5。活化结束后，用0. 5m的盐酸调节溶液ph值至8. 5,终止反应。然后，分别加入三种 不同的异型双功能试剂（n-2-胺乙基-马来酰亚胺，胺-peg2k-马来酰亚胺和胺-peg5k-马 来酰亚胺），多糖与异型双功能试剂的质量比为1: (0.5-10)，于室温下反应6-24小时；其中 优化的质量比为1: 1，于室温下反应16小时。多糖活化后的氰基与异型双功能试剂一端的 氨基反应。反应结束后，用透析袋充分透析，除去未反应的溴化氰和异型双功能试剂。
[0017] 2)载体蛋白的活化
[0018] 载体蛋白溶于生理盐水中，浓度为8. 5mg/ml，然后加入2-亚氨基硫烷 (2-iminothiolane)进行活化6-24小时，载体蛋白与2-亚氨基硫烧的摩尔比为 1: (10-50)，其中优化的活化时间为16小时，摩尔比为1:30。2-亚氨基硫烷会将载体蛋白 上暴露在外面的氨基转化成巯基。活化结束后，用透析袋透析充分除去未反应的2-亚氨基 硫烧。
[0019] 3)多糖与载体蛋白的偶联
[0020] 将第1步得到的活化多糖与第2步得到的活化载体蛋白混合，多糖与载体蛋白的 质量比为（〇. 2-3) :1，于4°c下反应12-36小时，其中优化的质量比为1:1，于4°c下反应24 小时。
[0021] 4)多糖结合疫苗的分离纯化
[0022] 制备的多糖结合疫苗需要与未反应的多糖和载体蛋白分离开来。纯化方法选用分 子排阻层析，优选superdex 200凝胶过滤柱（2. 6cmx60cm)。
[0023] 本发明的多糖结合疫苗，可添加免疫佐剂，如氢氧化铝或磷酸铝等佐剂，用于进一 步提高疫苗的免疫原性。
[0024] 本发明制备了以peg为连接桥的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，其技术优势体现在以 下几方面：
[0025] 1)本发明使用异型双功能试剂作连接桥，即连接桥两端不同的2个官能团能分别 连接荚膜多糖和载体蛋白，可有效地避免在制备过程中荚膜多糖和蛋白质的自身偶联，能 够提高结合产物的收率，并且利于产品的质量控制。
[0026] 2)本发明提供的多糖蛋白结合技术，未显著改变荚膜多糖和载体蛋白的结构特 征。
[0027] 3)本发明使用peg作为连接桥，可有效延长荚膜多糖与载体蛋白之间的空间距 离，减小了载体蛋白对荚膜多糖抗原表位的空间屏蔽效应，有利于提高荚膜多糖的免疫原 性。
[0028] 4)本发明使用peg作为连接桥，由于peg亲水性较强，因此在水溶液中，其外侧会 形成一个巨大水化层，该水化层会对载体蛋白与多糖分子形成不同程度的屏蔽效应，具体 来讲，由于载体蛋白为球形，peg水化层对其屏蔽效应会较为强烈，但多糖作为一种线状分 子，peg水化层对其屏蔽效应会大大减弱。
【附图说明】
[0029] 图1多糖结合疫苗的制备反应示意图。
[0030] 图2凝胶过滤分析多糖结合疫苗。用分析型凝胶过滤柱superdex 200 (icmx 30cm)检测多糖结合