脂多糖结合蛋白在制备类风湿关节炎相关药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因重组工程，特别是涉及脂多糖结合蛋白的用途。具体而言，本发明 涉及利用elisa检测ra患者血清及关节液中的lbp，从而制备相应的类风湿关节炎相关试 剂盒，提供脂多糖结合蛋白的一种新的制药用途。
【背景技术】
[0002] 脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，lbp)，是主要由肝细胞 (肾近曲小管上皮细胞、肺泡壁ii型细胞也可少量合成）产生的一种介导内毒素与靶细胞 受体结合的急性期应激反应蛋白，它能显著促进脂多糖（lipopolysaccharide，lps)与单 核/巨噬细胞膜表面的⑶14 (mcd14)结合，形成lps-lbp-⑶14复合物，经单核/巨噬细胞 膜上的 toll-like receptor4(tlr4)_myeloid differentiation protein2(md_2)-myd88 识别复合物转导，再经多显性转录核因子（nuclear factor kappa b，nf-kappa b)向胞核 内传递信号，激活单核-巨噬细胞，促进炎性因子的分泌及炎症的发生、发展，导致肝、肺、 肾等重要脏器发生严重损害。
[0003] 人脂多糖结合蛋白（lbp)基因全长28. 5kb，位于人染色体20qli. 23-ql2上，含有 14个外显子，编码与脂多糖结合部位的基因位于第3、4外显子（即成熟完整lbp的n端 区），基因5'端含有急性期反应蛋白所共有的启动子急性期反应元件/信号传导转录活 化3 (apre/stat-3)，启动子与外显子之间还含有促炎症转录因子活化蛋白i(ap-i)和c/ ebp转录因子，3 ^端为富含aataaa的非编码区，因此lbp基因能在急性期被激活、分泌表 达。成熟完整脂多糖结合蛋白的相对分子量（mr) 60kda，其家族包括人脂多糖结合蛋白、 杀菌通透性增强蛋白（bactericidal permeability-increasing protein，bpi)、血衆胆 固醇脂转移蛋白（plasma cholesteryl ester transfer protein，cetp)、磷脂转移蛋白 (phospholipid transfer protein，pltp)等。脂多糖结合蛋白的n端在空间上形成两个无 极性的脂性结合位点，为人脂多糖结合蛋白与脂多糖的结合点，人脂多糖结合蛋白与cd14 的结合部位则位于脂多糖结合蛋白的c-末端。
[0004] 脂多糖结合蛋白能显著的促进脂多糖与mcd14结合，nanbo等人发现人脂多糖结 合蛋白可将机体对脂多糖识别的敏感度提高1000倍，在炎症急性反应早期，当血清脂多糖 浓度相对较低时，就已有微量脂多糖结合蛋白参与，并且只有在脂多糖结合蛋白存在情况 下机体才能对小剂量的脂多糖或细菌产生反应，从而增强机体抗感染作用，但在急性炎症 反应中后期，当血清脂多糖结合蛋白含量升高时，脂多糖结合蛋白会导致单核/巨噬细胞 过度活化，大量分泌白细胞介素（?υ-1β、il-6、肿瘤坏死因子- α (tnf-ci)等细胞因子， 这些因子又强烈地加速脂多糖结合蛋白基因的转录和脂多糖结合蛋白多肽的合成，进而导 致机体严重损害，出现感染性休克、弥漫性毛细血管内凝血（dic)、多脏器衰竭（mof)(见 eur j biocheml999, 260(1) :183-191)等，因此如何抑制过度的炎症反应和防止弥漫性毛 细血管内凝血、多脏器衰竭的发生已成为当今临床工作中的一个重要研究方向。
[0005] 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，ra)是一种以慢性、进行性、侵袭性关节炎 为主要表现的全身性自身免疫病。该病在我国患病人数较多，且具有高致残率，为社会经济 带来巨大负担。目前临床上，crp和esr是最常用于ra病情评估的血清学指标，新的炎症 因子和自身抗体亟待被发现，从而使ra的血清学诊断与病情评估正在向更全面、更准确方 向发展。
[0006] 现有技术认为患者血液中脂多糖结合蛋白浓度可作为判断损伤、预后的一个重要 参考指标，但lbp与免疫系统疾病，尤其是lbp与类风湿关节炎之间的相互关系并没有人进 行研究，也并没有相关的实验结果证实两者之间具有相关性。
【发明内容】
[0007] 我们通过质谱分析技术共发现26多种蛋白质在ra患者及正常对照者血清中的免 疫复合物中有差异性表达，其中脂多糖结合蛋白（lbp)被证明在ra循环免疫复合物中升 高，进一步研究发现，lbp是ra的特异性血清标志物，并可以对ra疾病活动度的评估和诊 断有重要作用。本发明目是对于应用酶联免疫吸附法检测lbp水平，并应用于ra的诊断和 疾病活动度评估。
[0008] 本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种脂多糖结合蛋白；
[0009] 本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种抗脂多糖结合蛋白的检测方法；
[0010] 本发明所要解决的技术问题之三在于提供一种抗脂多糖结合蛋白与类风湿关节 炎疾病相关性；
[0011] 本发明所要解决的技术问题之四在于提供一种脂多糖结合蛋白的检测试剂盒；
[0012] 本发明所要解决的技术问题之五在于提供一种抗脂多糖结合蛋白的制药用途。
[0013] 为实现本发明目的而提供的一种脂多糖结合蛋白氨基端片段，编码所述脂多糖结 合蛋白的氨基酸序列为：
[0014] i mgalaralps illallltst pealganpgl varitdkglq yaaqegllal qsellritlp
[0015] 61 dftgdlriph vgrgryefhs lkihscellh salrpvpgqg lslsisdssi rvqgrwkvrk
[0016] 121 sffklqgffd vsvkgisisv nlllgsessg rptvtasscs sdiadvevdm sgdlgwllnl
[0017] 181 fhnqieskfq kvlesricem iqksvssdlq pylqtlpvtt eidsfadidy slveaprata
[0018] 241 qmlevmfkge ifhrnhsspv tllaavmslp eehnkmvyfa isdyvfntas lvyheegyln
[0019] 301 fsitddmipp dsnirlttks frpfvprlar lypnmnlelq gsvpsaplln fspgnlsvdp
[0020] 361 ymeidafvhl pssskepvfr lsvatnvsat ltfntskitg flkpgkvkve lkeskvglfn
[0021] 421 aelleallny yilntfypkf ndklaegfpl pllkrvqlyd lglqihkdfl flganvqymr
[0022] 481 v (seq id no. i)
[0023] 或被上述序列所包涵的任何氨基酸序列片段。
[0024] 本发明的有益效果是：本发明通过从人脂多糖结合蛋白入手，我们通过质谱分析 技术共发现26多种蛋白质在ra患者及正常对照者血清中的免疫复合物中有差异性表达， 其中脂多糖结合蛋白（lbp)被证明在ra循环免疫复合物中升高，进一步研究发现，lbp是 ra的特异性血清标志物，并可以对ra疾病活动度的评估和诊断有重要作用。
【附图说明】
[0025] 图i ra患者及对照组血清中lbp浓度测定：ra患者血清中lbp浓度显著高于健 康人群及疾病对照（p< 0.0001)。图中用虚线标出ra诊断的cutoff值（52. 95 μ g/ml，敏 感性 43. 3 %，特异性 96. 5 %，auc 0· 82):
[0026] 图2 lbp与ra临床及实验室指标相关性分析；
[0027] 图3不同疾病活动度ra患者血清中的lbp水平分析。
【具体实施方式】
[0028] 为了更清楚地理解本发明，现参照下例实施例及附图进一步描述本发明。实施例 仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明的具体条件的实验方法为所属领 域熟知的常规方法和常规条件，或按照试剂盒及仪器制造商所建议的条件。
[0029] 实施例：脂多糖结合蛋白在类风湿关节炎诊断及疾病活动度中的作用研究
[0030] 一、病例及对照样本入选标准
[0031] 120例ra患者均为2013年~2014年期间在北京大学人民医院风湿免疫科住院患 者，符合1987年美国风湿病学会（acr)制定的ra分类标准，其中，女性92例，男性28例，年 龄29~89岁，平均60. 27 ± 10. 59岁，病程1~5 1年，平均12. 16 ± 8. 69年。选取32例骨关 节炎（osteoarthritis，0a)患者，30 例系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus， sle)患者，30例原发性干燥综合征（primary sj0gren' s syndrome，pss)患者作为疾病对 照组，51例健康志愿者作为健康对照组（hc)。各组血清均来源于临床检验的剩余标本。ra 患者的临床资料米集如下：
[0032] (1)临床资料：包括性别、年龄、病程、治疗、合并感染及代谢病情况、皮下结节、肺 部损害、血液系统损害、肾脏损害、眼部病变和疾病活动性评分。
[0033] ①感染的定义：临床上依据患者症状、体征、辅助检查，确定诊断各系统或全身感 染。
[0034] ②代谢病包括：高血压病、糖尿病、冠心病、高脂血症、高尿酸血症、周围动脉粥样 硬化症等一系列由于代谢紊乱所致的心脑血管疾病。
[0035] ③das28评分：观察双侧肩、肘、腕、膝、掌指及近端指间关节等共28个关节的压 痛及肿胀情况，并结合血沉进行计算打分，以反映 ra患者病情活动程度。可通过das28 calclator 1. l-β软件进行计算：das28 = 0. 56x压痛关节数 0. 128x肿胀关节数 0· 7 x in (esr) xl 08 0. 16)。
[0036] (2)实验室指标：
[0037] ①血沉（esr):魏式法检测，正常值< 20mm/h ;
[0038] ②c反应蛋白（crp):免疫比浊法检测，> 8mg/l认为异常；
[0039] ③igm类风湿因子（rf):免疫比浊法检测，> 20iu/ml认为异常；
[0040] ④抗ccp抗体：采用第二代elisa试剂盒（德国欧蒙）定量法检测；
[0041] ⑤aka和apf :间接免疫荧光法检测，滴度> 1 : 10判定为阳性，分别记录阳性和 阴性患者例数；
[0042] ⑥免疫球蛋白（igg、igm、iga):采用美国贝克曼公司蛋白分析仪测定。
[0043] 二、实验方案
[0044] elisa方法检测lbp的水平
[0045] 本研究米用hycult biotech公司生产的hk315，human lbp elisa kit试剂盒进 行ra血清或关节液中lbp的测定，具体步骤如下：
[0046] 1、清洗样本孔，将0. 5 μ l血清