专利名称：脂多糖净化的制作方法
技术领域：
本发明涉及脂多糖净化领域。
背景技术：
当革兰氏阴性菌如大肠杆菌(escherichia coli)及肠沙门氏菌(salmonella enterica)倍增或裂解时，即释放脂多糖。它是一种强力细菌毒素，称作内毒素，是许多种与 革兰氏阴性菌感染有关的毒性及致免疫效应的根源。内毒素是从细菌制备的质粒脱氧核糖 酸中常见的污染物，因此必须在投入体内应用之前除去，以便防止任何不良炎症应答。类似 地，必须对从革兰氏阴性菌制备而来的其它生物分子(例如革兰氏阴性菌荚膜多糖大肠杆 菌衍生的重组蛋白)和药物用水进行纯化，去除残余内毒素。因此，在纯化有生物医药用途的分子时需要能够选择性地去除脂多糖或内毒素。
发明内容
本发明提供用于在纯化有生物医药用途的分子的过程中选择性地去除脂多糖的 材料和方法。因此，本发明提供用于吸附脂多糖的膜，其包含可结合脂多糖的聚合物基材。较佳 地，该聚合物基材至少对庚糖和2-酮基-3-脱氧辛酸(2-keto-deoxyoctonic acid)之一 具有选择性。本发明还提供一种制备结合脂多糖的聚合物基材的过程，所述过程包括以下步 骤i.接触均相聚合物溶液和模板溶液；ii.对所得溶液进行相转化处理；以及iii.除去模板。本发明进一步提供制备结合脂多糖的聚合物基材的另一种过程，所述过程包括以 下步骤i.接触单体溶液和模板溶液；ii.使单体中的交联基团反应形成聚合物；以及iii.除去模板。较佳地，各过程进一步包括制作膜的步骤。除此之外，本发明提供一种从悬浮液中去除脂多糖的方法，包括以下步骤i.提供一种可结合脂多聚合物基材；以及使所述悬浮液接触聚合物基材。附图简述
图1显示了在用kdo印迹膜和非印迹膜过滤后的内毒素回收％。方块是mim的； 三角是匪im的。x轴是滤液体积(ml)。图2显示了在用重复使用的kdo印迹膜和非印迹膜过滤后的内毒素回收％。实心 条是mim，空心条是匪im。x轴是滤液体积(ml)。发明详述革兰氏阴性菌本发明涉及衍生自革兰氏阴性菌的脂多糖。这些细菌中有许多品种是致病 的，该特性与细菌细胞的脂多糖层有特别关联。革兰氏阴性菌包括但不限于蛋白菌 (proteobacteria)，包括埃希氏菌属(escherichia)、沙门菌属(salmonella)、以及其它肠 杆菌科、假单胞菌属(pseudomonas)、莫拉菌属(moraxella)、螺杆菌属(helicobacter)、寡 养单胞菌属(stenotrophomonas)、虫至弧菌属(bdellovibrio)、耳口尔森氏菌属(yersinia)、 醋酸菌和军团菌属(legionella)；蓝藻菌；螺旋体；绿色硫细菌和绿色非硫细菌。革兰氏 阴性球菌包括淋病奈瑟氏球菌(neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseria meningitidis)和粘膜炎莫拉氏菌(moraxellacatarrhalis)。革兰氏阴性杆菌包括流感 嗜血杆菌(hemophilus influenzae)、月市炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、侵月市军 团菌(legionellapneumophila)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌、 奇异变形菌(proteus mirabilis)、阴沟肠杆菌(enterobacter cloacae)、粘质沙雷氏菌 (serratia marcescens)、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)、肠炎沙门菌(salmonella enteritidis)、和伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)。医院革兰氏阴性菌包括鲍氏不动杆 菌(acinetobacter baumannii)。脂多糖革兰氏阴性菌细胞膜的最外层主要地由脂多糖组成，不管衍生自何种细菌，其全 部具有共同的基本结构，由称作脂质a的脂质成分以及亲水的杂多糖组成。脂质a提供将 分子固定在膜内的锚，而多糖成分自表面凸出并与外部环境相互作用。脂多糖的杂多糖单元由两部分组成寡糖芯和外部的o-特异性多糖侧链，该侧链 包含寡糖的复杂聚合物，其决定了脂多糖的抗原特异性，常称作o-抗原。这个成分对于合 成它的特定细菌而言是特有的；不同的细菌合成在o-特异性多糖侧链的长度以及精细结 构方面有差异的脂多糖分子。芯的内部部分包含特征性及不同寻常的成分庚糖(系l-甘 油-d-甘露-构型)和2-酮基-3-脱氧辛酸(或3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸)(kdo).在本发明中，术语“庚糖，，应理解为是指“ l-甘油-d-甘露-庚糖，，而术语“ 2-酮 基-3-脱氧辛酮酸”应理解为是指“3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸。，，较佳地，形成本发明的膜的聚合物基材至少对庚糖和2-酮基-3-脱氧辛酸之一具 有选择性。如上所述，这些不同寻常的糖类是脂多糖的特征。能够重新组织并且选择性地 结合这些部分的聚合物基材可以从悬浮液中去除脂多糖。脂多糖的吸附本发明提供一种用于吸附脂多糖的膜，包括可结合脂多糖的聚合物基材。在本发 明的上下文中中，“膜”是一种溶液或悬浮液中的特定物质可以透过的薄层材料。本发明的 膜是一种用聚合物基材或基质制成的连续介质，可以形成平的、凹的或凸的片材，或者可以 是任何适当形状。那些被阻止透过该膜的分子按其物理或化学性质而区别对待。本发明的用于从悬浮液中去除脂多糖的方法可以采用不同的聚合物基材排列方式，比如悬浮液中的 不连续颗粒或微球体。或者，聚合物基材可以结合在固态支持物上，比如珠、板、柱、过滤器 或多孔固体。所发生的吸附可以是物理吸附或化学吸附或者二者兼而有之。吸附在了聚合物基 材的那些分子从正在处理的悬浮液中去除。在处理了悬浮液之后，吸附在了聚合物基材的 分子用本领域熟知的方法除去，以便使聚合物基材可以重新使用。聚合物基材可以用本领域熟知的任何合适的单体、聚合物及共聚物的组合来制 作。较佳地，聚合物基材通过分子印迹技术制作。该技术生产出能够进行分子识别的聚合 物基材。聚合物基体能够区别化学物质并结合那些展示特定官能团的物质，因而得到高水 平的选择性。another本发明的另一方面提供一种通过在模板存在下将一组功能单体聚合来形 成分子印迹聚合物基材方法。该功能单体可以包含能够与模板形成结合性相互作用的功能 性头基团以及能够以共价键与其它单体结合的交联基团。聚合反应步骤可以涉及链增长聚 合或者逐步增长聚合，可以用本领域熟知的任何方式引发。本发明是又一方面提供一种通 过将含有模板的均相聚合物溶液进行相转化处理来形成分子印迹聚合物基材的方法。随后将模板摘除则在聚合物基材中留下了与模板在大小、形状和功能性方面互补 的空穴。该空穴能够结合孤立的模板或者在其结构中引入了模板的功能性的分子(即包括 官能团的相同具体排列)。因而，在本发明中，庚糖和/或2-酮基-3-脱氧辛酸或包含其化 学结构的小的寡糖可以用作制造选择性地结合脂多糖的聚合物基材的模板。形成聚合物基 材的方法涉及模板溶液的应用，其中的模板溶液较佳地包含庚糖和2-酮基-3-脱氧辛酸中 的至少一种，以便赋予聚合物基材所需的选择性。这些分子印迹聚合物基材可以随后做成 多孔膜，供本发明的生物分离之用。在一个优选实施方式中，聚合物基材通过相转化处理得到。聚合物基材可以包含一个或多个极性基团。例如，聚合物基材可以包含一个或多 个胺、羟基或巯基，特别是羟基。本发明人发现，包含羟基的聚合物基材能够结合脂多糖。例 如，聚合物基材可包含聚(乙烯-共-乙烯醇)(polykthylene-co-vinyl alcohol))，这 是一种可以用在通过相转化处理来形成分子印迹聚合物基材的方法中的共聚物。以商品名 eval 出售的这种共聚物的性质通过控制单体组分乙烯和乙烯醇的聚合比例以及在聚合反 应过程中所达到的聚合度来决定。所得的无规晶状聚合物用以下分子式表示- (ch2-ch2) m- (ch2-choh) n-式中m和η是整数。可以使用任何适当比例的乙烯共-乙烯醇。特别地，可以 使用30-60 70-40的比例，特别是40-50 60-50的比例。例如，比例30 70,31 69、 32 68,33 67,34 66,35 65,36 64,37 63,38 62,39 61,40 60,41 59、 42 58,43 57,44 56,45 55,46 54,47 53,48 52,49 51,50 50,51 49、 52 48,53 47,54 46,55 45,56 44,57 43,58 42,59 41 或 60 40 皆可使 用，尤其是比例 40 60,41 59,42 58,43 57,44 56,45 55,46 54,47 53、 48 52,49 51或50 50。本发明人发现，比例44 56适合结合脂多糖。本发明的另一个方面提供一种从悬浮液中去除脂多糖的方法，包括使悬浮液与如 上所述的结合脂多糖的聚合物基材相接触。聚合物基材的形式可以是膜或者是不连续颗粒或者是附着在固态支持物上。较佳地，悬浮液包含水，例如生物流体的形式。悬浮液最好包 含药物成份。更加优选的是，该药物成份是细菌疫苗。lps可以从中去除的其它材料是用在 制备和/或配制包含该药物成份的最终剂型的材料。概述术语“含有”包括“包含”以及“由…组成”，例如“含有” x的组合物可仅由x组成 或可包含其它物质，例如x y。术语“悬浮液”囊括了溶液以及任意的胶体分散体，其中一个物质或者保持悬浮在 溶剂中或者变成溶剂化物形成均一的混合物。术语“药物成份”是指供人用或兽用的药品。本发明的方法可以用于制备和/或分析目的。提及“制备”等时应当理解为排除 了分析方法。术语“细菌疫苗”是指能够施用以便感生免疫应答用于预防或治疗细菌性疾病的 细菌悬浮液、减毒或杀灭细菌、其抗原衍生物。术语“寡糖”是指含有少量的(通常3至20个)成分糖的糖聚合物。“固态支持物”是在特定溶剂体系(例如水或有机溶剂)中不溶解的某种东西。可 能是由上面可以结合聚合物基材的玻璃、陶瓷、金属、塑料、木头、或任何其它材料组成的。应该明白，在此描述的化合物中的可离子化基团可以是处于中性形式或者带电荷 的形式，例如取决于ph值。例如，羧基-cooh可以失去质子得到阴离子-c00_基团。本发 明中可以采用带电荷分子的任何盐。
具体实施例方式用于lps俘获的分子印迹膜的制备、表征及测试引言用于特异性识别kdo的膜利用分子印迹技术制备。该膜利用相转化法制作。用于 制造这个膜的聚合物溶液是eval (聚(乙烯-共-乙烯醇))，乙烯共-乙烯醇比例是 44 56。模板溶液包含kdo。膜的制备匪im-非印迹(对照)膜(在无模板的情况下制备)。15 %的配制在dmso中的 eval 悬浮液在ioctc搅拌加热，直至获得均相溶液。将2至3. 5ml的该溶液倾至8. 5x14cm2 的玻片支持物上，用刀切割得到400 μ m厚的均相层。该层用400毫升由h20/dms0(50/50 ν/ν)构成的第一凝固(转化)浴进行凝固处理1个小时。然后将膜置于400毫升的水中6 个小时。在转化步骤结束时，将膜干燥并冻干。所得膜的厚度是200 μ m。mim-印迹(测试)膜(在有模板的情况下制备)。该膜以与以上相同的步骤制备， 但起始悬浮液是3毫升15%的用dmso配制的eval 悬浮液，含有50毫克kdo。在膜制备 之后，通过利用再循环系统在0. 2巴的压力下用水对膜进行广泛冲洗，去除残余的模板。测试膜对kdo的容量为测定mim对kdo的结合容量，使100毫升10 μ g/ml的kdo水溶液通过安装在过 滤装置上的mim再循环过夜。基于溶液的总体积和再循环期间使用的膜的重量，用0时和再 循环结束时再循环溶液中kdo浓度的差值计算对kdo的结合容量。观察到的值是大约每毫
7克膜8yg。在一个类似实验中，匪im对kdo没有显著的结合容量。为了测试mim膜对kdo 的选择性，进行了一个类似的实验，其中用唾液酸置换kdo。未观察到对唾液酸有显著结合 容量(每毫克膜1 μ g)。唾液酸和kdo浓度是用osborn (1963) pnas，50 =499-506的过程确 定的。lps结合实验切割出一段mim膜并装到过滤支架上，使过滤面积为4. 9cm2。然后使用注射器以 无热原蒸馏水冲洗该系统，随后是0. im的naoh，并再次用蒸馏水，直至渗透物呈中性ph。用注射器使10毫升浓度为50ui/ml (总共500ui)的标准大肠杆菌脂多糖(lps)溶 液通过膜。收集4份2. 5ml流分，从每一份取0. 7ml样品进行内毒素浓度的鲎变形细胞裂 解物(lal)分析。这些流分随后倒在一起(收集池1)，从倒在一起的总渗透物中取0.7ml 样品用于分析。使6ml倒在一起的渗透物再次通过膜。这一次收集4份1. 5ml流分，从每一份取 0. 7ml样品用于分析。这些流分随后倒在一起(收集池2)，再取0. 7ml样品用于分析。在使用之后，膜用蒸馏水、0. im naoh、并再次用蒸馏水冲洗，直至渗透物呈中性 ph。对滤器上的起始材料(sm)以及其它样品的内毒素浓度做了分析(表1)。表1 印迹膜(mim)kdo结合实骑
样品体积 (ml)ui/ml总ui回收％起始材料加载量1041. 8418100洗涤过滤器< 0. 05流分1/12. 55. 2213. 053. 1流分2/12. 59. 3723.4255. 6流分3/12. 59. 3923.4755. 6流分4/12. 58. 5321.3255. 1流分1-4份总ui81. 2719. 4收集池1104. 9149. 111. 7收集池164. 9129. 46流分1/21. 54. 636. 94523. 6
8 用匪im膜进行同样条件下的实验(表2)。表2 非印迹膜(匪im) kdo结合实验 这两个实验的结果汇总在图1中。这两个实验用相同的(即使用过的)mim和匪im 膜重复(表3，图2)。表3 用寸的mim和nmim腊讲行的结合实龄 讨论能够选择性地结合kdo (lps的一种保守成分)的膜已经制备出来了。
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新制备的印迹膜(mim)对lps的潜在结合容量约为初始载量的约80%。对照膜 (匪im)未表现出任何显著的lps结合(比较表1和2，图1)。mim滤液包含约12%的初始 lps载量(表1，收集池1)。然而，在膜用蒸馏水冲洗并再次加载lps后，未观察到进一步的 lps结合(表1，收集池2)。这表明膜已被lps饱和。当重新使用该膜时，观察到不同的性能(表3)。两个膜似乎保留了大约50-60%的 初始lps载量。然而，对lps累积回收的分析表明，印迹膜仍然显示出对lps的较大结合， 至少在过滤过程开始时如此(图2)。用再使用的膜观察到的结果表明，膜的再利用并非首 选。不希望被理论所限制，有可能在膜的首次使用之后发生了结构性变化，这种变化给了膜 不同的性质，或许是无特异性结合。作为替换/除此之外，有可能是在再使用之前对mim膜 的洗涤步骤进行的不充分，不足以去除所有的结合lps，即并非所有的初始kdo结合位点皆 可用。这些结果证实，能够用分子印迹技术的原理制造识别并结合水溶液中lps的过滤膜。应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可以进行修改而仍在本发明的范围和构 思内。
1权利要求
用于吸附脂多糖的膜，其包含可结合脂多糖的聚合物基材。
2.如权利要求1所述的膜，其特征在于，所述聚合物基材至少对庚糖和2-酮基-3-脱 氧辛酸之一具有选择性。
3.如权利要求1或2所述的膜，其特征在于，所述脂多糖来自革兰氏阴性菌。
4.如权利要求3所述的的膜，其特征在于，所述革兰氏阴性菌是蛋白菌、蓝藻菌、螺旋 体、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、圆齿古细菌(crenarchaeota)、球菌、杆菌或医院细菌。
5.一种形成结合脂多糖的聚合物基材的过程，所述过程包括以下步骤 i.接触均相聚合物溶液和模板溶液； .对所得溶液进行相转化；以及 iii.除去所述模板。
6.一种形成结合脂多糖的聚合物基材的过程，所述过程包括以下步骤 i.接触单体溶液和模板溶液； .使所述单体中的交联基团反应形成聚合物；以及 iii.除去所述模板。
7.如权利要求5或6所述的过程，还包括制作膜的步骤。
8.如权利要求5至7中任一项所述的过程，其特征在于，所述模板溶液包含庚糖和 2-酮基-3-脱氧辛酸中的至少一种。
9.一种从悬浮液中去除脂多糖的方法，所述方法包括以下步骤 i.提供一种结合脂多糖的聚合物基材；以及 .使所述悬浮液接触所述聚合物基材。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述聚合物基材是膜的形式。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述聚合物基材是不连续颗粒的形式。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述聚合物基材附着在固态支持物上。
13.如权利要求9至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚合物基材至少对庚糖 和2-酮基-3-脱氧辛酸之一具有选择性。
14.如权利要求9至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述脂多糖来自革兰氏阴性菌。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述革兰氏阴性菌是蛋白菌、蓝藻菌、螺 旋体、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、圆齿古细菌或医院细菌。
16.如权利要求9至15中任一项所述的方法，其特征在于，所述悬浮液包含水。
17.如权利要求9至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述悬浮液包含药物成份。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述药物成份是细菌疫苗。
19.如前述任一项权利要求所述的膜、过程或方法，其特征在于，所述聚合物基材包含 一个或多个极性基团。
20.如权利要求19所述的膜、过程或方法，其特征在于，所述聚合物基材包含一个或多 个羟基。
21.如前述任一项权利要求所述的膜、过程或方法，其特征在于，所述聚合物基材包含 聚(乙烯-共-乙烯醇).
22.如权利要求21所述的膜、过程或方法，其特征在于，所述聚(乙烯-共-乙烯醇)中乙烯共-乙烯醇的比例为30-60 70-40。
23. 一种用权利要求5-7中任一项所述过程制得的聚合物基材。
全文摘要
在纯化有生物医药用途的分子的过程中选择性除去脂多糖的材料和方法，所述材料和方法基于结合脂多糖的聚合物基材。优选地，所述聚合物基材选自庚糖和2-酮基-3-脱氧辛酸中的至少一种。所述基材可通过包括以下步骤的过程形成(i)接触均相聚合物溶液和模板溶液；(ii)对所得溶液进行相转化；以及(iii)除去所述模板。
文档编号b01j20/26gk101909742sq200980102069
公开日2010年12月8日 申请日期2009年1月7日 优先权日2008年1月7日
发明者g·西雅德利, n·巴巴尼, p·科斯坦蒂诺 申请人:诺华有限公司