用于改善作物生产率及减少氧化亚氮排放的固氮细菌接种剂的制作方法
【专利说明】用于改善作物生产率及减少氧化亚氮排放的固氮细菌接种 剂
[0001] 序列提父
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【背景技术】
[0003] 本发明涉及通过施加含有固氮细菌的新型人工制造的配制物，减少化肥使用和温 室气体氧化亚氮（n 2o)排放的方法，以及改善农业中的植物生长率和种子生产率的方法， 所述固氮细菌有效定殖在非豆类植物的地上部分和根系中。该细菌接种物和方法特别适 合于麻疯树属（jatropha)、高粱属（sorghum)、棉属（gossypium)、油棕属（elaeis)、稻属 (oryza)、蓖麻属（ricinus)和木薯属（manihot)植物。
[0004] 化石燃料价格快速上涨、全球燃料的快速减少和关于起因于大气温室气体累积的 快速全球变暖的忧虑已充当近期生物燃料热潮的三大催化剂（chang，2007)。生物燃料消耗 的环境效益归于广泛认为的温室气体（co 2)排放减少的结果。
[0005] 近来，新的问题已造成关于生物燃料益处的讨论。氧化亚氮在微生物的硝化作用 和反硝化作用过程期间在土壤中天然产生。在生物燃料生产中使用的显著百分比的氮肥转 换为活性氮n 2o,具有310倍在大气中捕获热能力的温室气体（barton和atwater，2002) 〇 如果氮肥的使用不受控制，则通过生物燃料消耗的co2缓和的益处将被抵消（galloway等 人，2008 ;melillo 等人，2009 ;crutzen 等人，2008)。
[0006] 氮肥的施加已变成现代农业中的基础实践，因为它对于维持竞争性的作物生产率 是极其重要的。已众所周知的是由于称为根瘤的固氮结构的存在，豆类需要少得多的氮肥 输入，在所述根瘤中大多数属于根瘤菌属（rhizobium)、中华根瘤菌属（sinorhizobium)、 中慢生根瘤菌属（mesorhizobium)和慢生根瘤菌属（bradyrhizobium) (jourand等人， 2004 ;kaneko等人，2000 ;stacey等人，1991 ;gottfert等人，2001)中的物种的固氮微生物 (固氮生物），与细菌形成天然有益的共生关系，所述细菌给植物供应氮源，同时从植物细 胞中获取碳源（long，1996 ;young和johnston，1989)。近来已发现一些例外。例如，结瘤 甲基杆菌（methylobacterium nodulans)是用于猪屎豆属（crotalaria)(豆科植物）中的 一些物种的根瘤诱导剂（renier等人，2011 ;jourand等人，2005)，并且固氮根瘤可以在一 些豆类的莖组织中发展（eaglesham 和 szalay，1983 ;dreyfus 和 dommergues，1981)。弗兰 克氏菌属（frankia)，革兰氏阳性土壤细菌也在蔷薇科（rosaceae)的少数物种中诱导固氮 根瘤的形成（moir等人，2011)。
[0007] 共生根瘤的形成涉及在固氮生物和宿主之间复杂的遗传和化学相互作用。例 如，当植物将大量下述甜菜碱和黄酮分泌到根际内时，在苜蓿中华根瘤菌（sinorhizobium meliloti)及其植物宿主之间的共生开始：4, 4' -二羟基-2' -甲氧基查耳酮、金圣草黄素、 菜蓟糖戒、4'，7-二轻基黄酮、6" -〇-malonylononin、甘草素、木庫草素、3'，5-二甲基木庫 草素、5-甲氧基藤黄菌素、美迪紫檀素、水苏碱、胡芦巴碱。这些化合物将苜蓿中华根瘤菌 吸引至植物的根毛表面，细菌在其中开始分泌结瘤因子（peters等人，1986 ;maxwell等人， 1989)。因此，形成共生根瘤的固氮几乎专一地在豆类物种中找到。慢生根瘤菌和根瘤菌与 植物生长促进根际细菌（pgpr)共享特征。如同其他pgpr，根瘤诱导细菌能够定殖非豆类植 物的根（antoun等人，1998)。
[0008] 固氮生物已在自由生活的细菌中发现，在其中棕色固氮菌（azotobacter vinelandii)得到最佳研宄。数目越来越多的固氮生物物种例如固氮螺菌属 (azospirillum)、草螺菌属（herbaspirillum)、伯克霍尔德菌属（burkholderia)、葡糖乙 酸杆菌属（gluconacetobacter)已报道与植物形成非典型共生关系（zehr，2011 ;radiers 等人，2004 ;pedraza，2008)。它们通常在表面根系上生长（根际细菌），尽管一些能够感染 植物组织（内生细菌）并进行固氮，其也能够促进植物生长。例如，美国专利7, 393, 678b2 描述了肺炎克雷伯氏菌（klebsiella pneumonia)菌株，其定殖根面（liu等人，2011)，在 化学氮施加的存在或不存在下能够促进谷类（小麦和玉米）生长。然而，仅特别分离的肺 炎克雷伯氏菌突变株能够进行满意的植物生长促进功能，因为固氮活性在大多数菌株中很 低。可能，内生固氮的最佳例子可以在甘蔗和野生稻中发现，其中草螺菌属、葡糖乙酸杆菌 属、肠杆菌属（enterobacter)、固氮螺菌属、swaminathania和乙酸杆菌属（acetobacter) 是固氮物种的可能贡献者（pedraza，2008 ;boddey等人，1995 ;baldani等人，2002 ; elbeltagy 等人，2001 ;saravanan 等人，2008)。光合慢生型根瘤菌科（bradyrhizobiaare) 是非洲野生稻短舌野生稻（oryza breviligulata)的天然内生菌，而甲基杆菌属物种 (methylobacterium sp.)的细胞间定殖和生长促进效应在普通稻oryza sativa l. cv c0-43中观察到，尽管后者被认为起因于细菌的植物激素分泌（senthilkumar等人，2009 ; chaintreuil 等人，2000)。
[0009] 固氮螺菌属的研宄指出类似于豆类中的结瘤和固氮，内生定殖过程受遗传控制， 并且表多糖生产抑制普通小麦苗中的内生定殖和固氮（kennedy等人，1997)。此外，阻断表 多糖合成的突变阻止通过豌豆根瘤菌（rhizobium ieguminosarum)的豌豆结瘤，而不是通 过菜豆根瘤菌（r.phaseoli)的豆类结瘤（borthakur等人，1986)。因此，固氮生物经由固 氮促进植物生长的能力是无法由其在其他植物中的表现预测的。
[0010] 麻疯树（jatropha curcas)是属于大戟科（euphorbiaceae)的小型木本植物。 几种独特特征使得它成为生化柴油生产的理想植物（fairless，2007 ;gaydou等人，1982 ; openshaw，2000)。这些包括在边际土地上生长的能力；对水的低需求；非食物作物状态和 与油棕的超过3年相比较，在种植后0. 5-2年内的快速油生产。相应地，几个亚洲国家特别 是印尼和印度已作出雄心勃勃的计划来促进麻疯树种植。几种其他植物作为生物燃料生产 的替代作物也已吸引强烈的兴趣。这些包括蓖麻子、高粱和甜高粱。
[0011] 因为麻疯树属靶向其中土壤养分很低的边际土地，所以对于氮肥的需求将高于其 他作物。因此，减少氮肥使用的任何技术将是高度期望的。今天，关于麻疯树属中天然存在 的固氮生物和这些微生物用于改善植物生产率的应用研宄甚少。类似情况可以在其他作物 例如高粱、蓖麻子和木薯中发现。
【发明内容】
[0012] 本发明涉及通过施加含有固氮细菌的新型人工制造的配制物，减少化肥使用和温 室气体氧化亚氮排放的方法，以及改善农业中的植物生长率和种子生产率的方法，所述固 氮细菌有效定殖在非豆类植物的地上部分和根系中。该细菌接种物和方法特别适合于麻疯 树属、高粱属、棉属、油棕属、稻属、蓖麻属和木薯属植物。
[0013] 在第一个方面，本发明提供了选自如本文描述的肠杆菌属、甲基杆菌属、鞘氨醇单 胞菌属（sphingomonas)和pleomorphomonas的细菌物种的生物学纯的培养物。在一些实 施方案中，本发明的细菌物种能够有效将大气队还原为氨，如通过植物中的乙炔还原测定 法（ar测定法）证明的。在一些实施方案中，n 2还原在叶面上发生。在其他实施方案中，n2 还原在叶面内部发生。在另外的实施方案中，n2还原在根面或根系上发生。在进一步的实 施方案中，队还原在根组织内部发生。在一些实施方案中，细菌物种能够在叶面、根面上或 植物组织内部有效自繁殖，而不诱导显著的植物防御反应，例如细胞死亡。在其他实施方案 中，本发明的细菌物种可以通过在如本文描述的不含添加的氮源的培养基中培养植物组织 提取物或叶面洗涤进行分离。
[0014] 在一个实施方案中，细菌物种的基因组dna与seq id no: 10具有至少97%且优选 至少98%同一性。在一些实施方案中，细菌物种是含有固氮所需的一组基因的肠杆菌属物 种。在一些实施方案中，肠杆菌属物种产生大量细胞外多糖（eps)或葡聚糖内切酶。在另 一个实施方案中，细菌物种的基因组dna与seq id no: 11具有至少97%且优选至少98% 同一"性。在一些实施方案中，细菌物种是pleomorphomonas物种，其中固氮能力被约0,1mm 至约0.5mm nh4 离子刺激。在另外的实施方案中，细菌物种的基因组dna与seq id no: 12 具有至少97%且优选至少98%同一性同源性。在一些实施方案中，细菌物种是能够在无氮 培养基中生长的鞘氨醇单胞菌属物种。在进一步的实施方案中，细菌物种的基因组dna与 seq id n0:14具有至少97%且优选至少98%同一性。在一些实施方案中，细菌物种是甲基 杆菌属物种。
[0015] 在第二个方面，本发明提供了包含如本文描述的选自肠杆菌属、甲基杆菌属、鞘氨 醇单胞菌属和pleomorphomonas的细菌物种的至少一种生物学纯的培养物的人工配制的 接种剂。在一个实施方案中，接种剂包含这些细菌物种的至少两种生物学纯的培养物的混 合物。在一些实施方案中，接种剂的制备包括在培养基中大规模生产本文描述的细菌物种， 任选以维持细胞生存以及人工接种并定殖宿主植物的能力的合适方式脱水。在一些实施方 案中，接种剂任选补充有痕量金属离子。在一个实施方案中，痕量金属离子选自钼（mo 2 )离 子、铁（fe2 )离子、锰（mn2 )离子或这些离子的任何组合。在另一个实施方案中，接种剂中 的痕量金属离子浓度为约〇. imm至约50mm。在一些实施方案中，接种剂和载体进行配制。 可以使用任何合适的载体，并且合适载体的例子包括但不限于β-葡聚糖、羧甲基纤维素 (cmc)、细菌eps、糖