一种膜化学发光层析检测技术及其应用的制作方法-ag尊龙凯时

本发明涉及医疗器械，特别涉及一种以膜为基础的化学发光免疫层析检测方法及其应用。

背景技术：

1、免疫学检测技术已被广泛用于医学和研究领域，以及环境、药物、食品和工业分析，用于通过抗体或抗原在溶液中确定大分子或小分子的存在或浓度是应用免疫学原理设计的测定抗原、抗体、免疫细胞及化学成分等的实验手段，广泛用于来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品。免疫分析的目标被检测的分子称为待检物，也称为抗原，通常为蛋白质，具有被抗体识别并特异结合的能力，也可以是一种大分子复合物。除了抗体与其待检物的结合外，产生可测量信号以响应这种结合的方式也是免疫分析的另一个非常重要的特征，包括辐射发射、改变颜色、在光下发光或诱发发光。常用的有免疫比浊法、免疫化学发光法、免疫荧光法、酶联免疫吸附分析法(elisa)、胶体金免疫层析法、荧光免疫层析法和乳胶免疫层析法，为免疫检测中的常规分析提供了简单、快速、高灵敏度和易于使用的方法。

2、免疫比浊法用于测定抗体和抗原的可溶性复合物，其中抗原-抗体复合物聚集形成可被光度计光学检测的颗粒，然后给出吸光度测量结果，以计算溶液中待检物的浓度。免疫层析法，也称为侧向流检测，是一种通过固相膜反应检测液体样本中待检物的存在或浓度的简单快速分析方法。。常用双抗体夹心一步法，检测中使用的可测量的指示剂包括胶体金、荧光染料、荧光微球、彩色乳胶微球和磁性纳米微球。指示剂标记的抗体标记复合物作为指示剂标记物并涂布在结合垫上，配对的非标记抗体用作捕获物并涂布于固相膜上。当样品加载到结合垫上时，样品中的待检物特异性地与指示剂标记的抗体结合，形成抗原-指示剂标记抗体的复合物，然后复合物在固相膜上层析流动，被配对的非标记抗体捕获并固定在固相膜上，在检测线上出现一个可测量的条带，用于进一步测量。该技术的特点是简单、快速、灵敏、成本低、易于操作。

3、化学发光免疫分析(clia)是一种免疫分析技术，指示剂采用可诱导发光的化学分子，是临床检测中应用最广泛的免疫分析方法，包括使用化学发光物质标记的直接化学发光分析方法和采用化学发光诱导酶标记的间接化学发光分析方法。直接化学发光法使用的标记用化学发光物质为吖啶酯类，而间接方法中使用的标记酶为辣根过氧化物酶时，反应底物为鲁米诺或其衍生物；为碱性磷酸酶时，底物为1，2-二氧环乙烷衍生物amppd。这些合成分子以及添加增敏剂可以进一步提高以磁珠为反应载体的免疫分析系统的分析灵敏度(mol-16/l)，这远远优于其他免疫分析方法，如ria、elisa、免疫层析和荧光免疫酶法等。目前常用化学发光管道磁微粒检测技术，但检测反应时间长，对检测设备的要求高，仪器操作路径复杂，检测通量相对降低，试剂需要冷链运输等影响其使用。

4、因此，建立一种与免疫层析技术相结合的化学发光免疫分析方法将更具有简单、经济、快速和易于使用等特点。然而，结合使用时检测噪声背景高和缺乏有效的线性检测范围是这种结合所面临的主要技术问题。因此，建立一种低噪声背景和高线性检测范围的化学发光免疫层析分析方法对进一步应用非常重要。

技术实现思路

1、本发明的目的是解决建立膜层析化学发光检测技术中所面临的无法建立有效的线性检测区间的技术障碍，具有检测灵敏度高、快速、成本低、操作方便等优点，提高了检测质量。

2、本发明提供了一种以膜为基础的化学发光免疫层析检测方法，特征在于，包括：固相膜、捕获剂、化学发光指示剂、化学发光标记物、助检液、化学发光反应液和化学发光检测仪，其中：所述捕获剂以分散分布的方式包被在所述固相膜上，所述捕获剂在所述固相膜上分散分布包被的面积与所述化学发光免疫层析检测的线性检测范围呈正相关关系。

3、上述检测方法中，所述的检测方法包括：所述的固相膜、捕获剂、化学发光指示剂、化学发光标记物、助检液、化学发光反应液和化学发光检测仪，其中：

4、1)所述化学发光标记物为采用化学反光物质标记的待检物特异性第一免疫结合物；

5、2)所述捕获剂为非标记的与所述待检物特异性第一免疫结合物具有待检物特异性配对结合特性的待检物特异性第二免疫结合物；

6、3)所述固相膜粘贴于支撑底片上，所述捕获剂以分散分布的方式包被在所述固相膜上，所述捕获剂在所述固相膜上分散分布包被的面积与所述化学发光免疫层析检测的线性检测范围呈正相关关系，且所述捕获剂在所述固相膜上单位面积的包被量以所述捕获剂在所述固相膜上分散分布并且不形成叠加聚集的包被状态为优选；

7、4)所述化学发光标记物与待检样本混合形成样本混合物，在样本混合物内的所述第一免疫结合物与所述待检物进行特异性结合形成待检物-化学发光标记物的第一复合物，然后样本混合物被加载并通过固相膜向前流动，并被远端的吸水结构吸收，目标分析物被固体膜上的第二免疫结合物捕获，形成化学发光标记物-待检物-第二免疫结合物的第二复合物，并被固定在所述固体膜上；

8、5)所述助检液为水溶性缓冲盐溶液，在完成捕获固定的所述固相膜上加载、流经并被远端的吸水结构吸收，清洗残留在所述固相膜上未被捕获固定的游离的所述指示剂和化学发光标记物，完成所述固相膜的清洗过程；

9、6)所述吸水结构吸收流经所述固相膜的水，位于所述固相膜的远端，并与所述固相膜形成直接连接，优选吸水纸垫；

10、7)所述固相膜在完成所述助检液的清洗过程后，置于所述化学发光反应液内，用所述化学发光检测仪进行发光量检测。

11、上述检测方法中，所述捕获剂在固相膜上以分散分布的方式包被，并包括三种不同的包被方式，均匀分散分布包被、梯度分散分布包被、节段性分散分布包被。

12、均匀分散分布的包被是指捕获试剂以相同浓度和相同包被量包被固相膜，形成包被捕获试剂在固相膜上均匀分布的包被。梯度分散分布的包被是指捕获试剂在固体膜上从近侧到远侧的包被浓度逐渐增加，形成包被捕获试剂在固相膜上呈梯度分布。节段性分散分布的包被是指将固相膜分成不同的区域，并在某些区域用一定浓度的捕获试剂包被，而在其他区域完全不含捕获试剂，形成固相膜上的分段、薄片状或零散分布的包被。

13、上述检测方法中，所述固相膜为硝酸纤维素膜和具有与硝酸纤维膜相似的蛋白质结合能力的其他多孔膜，包括硝酸纤维膜、聚偏氟乙烯膜(pvdf)、尼龙膜和deae纤维素膜。

14、上述检测方法中，所述化学发光指示剂选择微粒结构，包括乳胶微球、彩色微球、磁微粒。彩色微珠包括彩色聚合物微珠和胶体金溶液。

15、上述检测方法中，所述化学发光标记物和所述捕获剂两者均含有免疫结合物，所述免疫结合物包括抗体、抗原、生物素、亲和素及其类似物。对于亲和素的类似物，streptavidin是此检测的常见选择。

16、上述检测方法中，标记制备所述化学发光标记物采用的化学发光指示剂可以是直接化学发光标记，如吖啶酯和吖啶磺酰胺，酶促化学发光标记，如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，电化学发光标记，如三联吡啶钌。

17、临床检测中最常用的化学发光免疫分析方法包括使用化学发光物质标记的直接测定或使用酶标记的间接测定。在直接测定中，使用的化学发光指示剂是吖啶和钌酯，与碱性状态的过氧化氢底物一起使用；而在间接方法中使用的酶标记包括使用1,2-二氧环己基苯酚酸酯(amppd)底物的碱性磷酸酶和使用luminol或其衍生物作为底物的辣根过氧化物酶。

18、上述检测方法中，所述化学发光反应液包括碱性状态的含有过氧化氢的直接发光反应液，以鲁米诺及其衍生物为发光底物的酶促化学发光反应溶液，以及三联吡啶钌类结构标记物所致直接电极反应的电化学发光反应液。

19、上述检测方法中，所述化学发光标记物的储存形态为冻干粉剂。

20、上述检测方法中，所述固相膜的近端设置有血细胞过滤结构，与所述固相膜的近端形成直接连接，所述血细胞过滤结构包括血细胞过滤膜或经红细胞抗体处理膜垫。

21、上述检测方法中，所述固相膜的近端设置有液相分散膜，与所述固相膜的近端形成直接连接，所述液相分散膜优选玻璃纤维素膜或多聚酯纤维素膜。

22、本发明的检测结构可以组装成三种可能的组合：1)所述固相膜粘贴于支撑底片上，其近端为液相分散膜、血细胞过滤结构，连接硝酸纤维素膜，远端为吸水垫，也连接硝酸纤维素膜；2)所述固相膜粘贴于支撑底片上，其近端为液相分散膜，连接硝酸纤维素膜，远端为吸水垫，也连接硝酸纤维素膜；3)所述固相膜粘贴于支撑底片上，其近端为血细胞过滤结构，连接硝酸纤维素膜，远端为吸水垫，也连接硝酸纤维素膜。这些组合可以在使用时连接，不使用时分离。

23、上述检测方法中，所述检测试剂条的制备还包括生物素/亲和素反应系统，所述样本混合物包括化学发光物质标记的第一免疫结合物和生物素标记第二免疫结合物，所述硝酸纤维素膜上包被有非标记的亲和素及其类似物。

24、上述检测方法中，所述的检测方法配置有化学发光定量检测仪，能够定量检测从固相膜发出的光量。

25、上述检测方法中，所述的检测方法的操作使用，包括如下步骤：

26、1)取包被有所述捕获剂的所述固相膜结构，在近端依次放置液相分散膜和/或血细胞过滤结构，在远端加载吸水结构，水平放置于平面；

27、2)取待检样本，加入至含有化学发光标记物的试管中，并加入适量的助检液，混合，制成待检样本混合液；

28、此时，样本中的待检物与化学发光标记物中的所述第一免疫结合物(第一抗体)结合，形成化学发光标记物 待检物的第一复合物，即化学发光物质-第一免疫结合物(第一抗体)-待检物(抗原)复合物，完成第一级检测反应。

29、3)将待检样本混合液加载至液相分散膜，向前流经血细胞过滤结构和固相膜，并被吸收到吸水垫中；

30、此时，所述第一复合物被包被固定在所述硝酸纤维素膜上的所述捕获剂捕获并固定，形成化学发光标记物 待检物 捕获剂的第二复合物，即化学发光物质-第一免疫结合物(第一抗体)-待检物(抗原)-第二免疫结合物(第二抗体)的复合物，完成第二级检测反应。

31、4)取助检液加载至液相分散膜，向前流经血细胞过滤结构、固相膜，被吸水垫吸收；

32、此时，所述助检液清洗特异结合和固定在固体膜上的化学发光物质及其复合物，形成低噪音的非特异性检测本底，完成第三级测试反应。

33、5)取所述固相膜，将其转移到化学发光反应液中，采用化学发光检测仪以定量检测固相膜上的发光量；

34、6)根据标准曲线，计算待检样本中待检物的浓度，完成检测。

35、所述的一种以膜为基础的化学发光免疫层析检测方法在免疫检测试剂产品开发中的应用。

36、本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：

37、1、本发明通过设计固相膜作为免疫化学发光检测的反应载体，全部待检物分离反应过程都在固相膜上完成，使化学发光检测反应的分离操作过程仅由向固相膜加载液相的简单操作步骤完成，进而使操作简单化，提高检测设备的检测通量。免疫化学发光检测包括待检物分离过程和分离后的待检物定量检测过程。市场常用的管道磁微粒化学发光检测技术其待检物分离过程均需要在磁微粒上完成，需要磁微粒标记及磁微粒在管道内的温控反应、磁微粒在管道内的转移和清洗等过程。本技术将待检物分离过程集中在固相膜上，全部结合、分离、清洗的过程均通过简单的检测液相在固相膜上的层析流动方式完成，不需要温控、不需要固相膜的转移，使检测过程简单化，不仅降低了检测成本，有效提高免疫检测技术产品临床检测的及时性和普及推广的可行性。

38、2、本发明通过设计在固相膜上采用分散分布方式包被并固定捕获剂，使捕获剂在固相膜上捕获固定的化学发光标记物得以充分的暴露，提高了化学发光标记物的发光检测效率，有效避免了现有膜层析检测技术中捕获剂集中喷线包被，检测时形成局部化学发光标记物的捕获聚集，使发光产生局部遮盖和淬灭，导致发光检测效率不足的技术障碍。

39、3、本发明通过设计捕获剂在固相膜上的分散分布方式包被，避免了化学发光标志物在固相膜上的聚集对发光检测的影响，进而实现了通过扩大包被面积提高待检物的线性检测区间的目的，满足多种样本检测的需求。

40、4、本发明采用固相膜作为待检物承载的载体，使待检物的捕获、分离和检测过程都在固相膜上完成。由于发明使用的固相膜，如硝化纤维膜，是多孔材料，固相膜的表面容积显著大于目前使用的磁微粒的表面容积，因而，提高了待检物的承载容积，扩大了化学发光检测中待检物的线性检测范围。

41、5、本发明设计了将液体溶液加载到测试膜上作为检测的唯一主要操作步骤，它节省了目前的管式磁性颗粒程序中的多个步骤，如温度控制、孵育、悬浮和磁分离。同时，由测试缓冲液进行的清洗过程也旨在加快流程，因此达到测试的反应平台所需的时间非常短且非常快。

42、6、本发明设计了化学发光标记物以冻干粉剂的形式储存，这简化了存储和运输过程，并可以在室温下存储，从而能够避免目前在化学发光检测试剂中使用的冷链运输。。

43、7、本发明设置了化学发光检测仪，可用于多种环境下的定量检测，提高了临床应用价值。

44、术语说明：

45、1、固相膜：指硝化纤维膜和具有相似蛋白结合性、多孔且不溶于水的膜结构材料。市场上常用的材料包括硝化纤维膜、聚偏氟乙烯膜(pvdf)、尼龙膜和deae纤维素膜。。

46、2、指示剂：也称为标记、化学发光物质，指在检测技术中能够用于直接检测并获得定量数值的可作为标记物使用的物质。本发明采用化学发光物质作为指示剂，包括酶化学发光免疫测定(cleia)的辣根过氧化酶和碱性磷酸酶，直接化学发光免疫测定(clia)的吖啶酯类和吖啶磺酰胺类，电化学发光免疫测定(ecli)的三联吡啶钌及其衍生n-羟基琥珀酰胺(nhs)酯。

47、3、免疫结合物：指能够与待检物直接或间接形成特异性结合的物质，包括抗原、抗体、生物素、亲和素等。

48、4、捕获剂：指能够包被固定的固相膜上并对待检物具有特异性免疫结合特性的物质，包括抗原、抗体、生物素、亲和素等；并与第一免疫结合物具有配对结合特性的物质，包括抗原、抗体、生物素、亲和素及其类似物，在本发明中也称为第二免疫结合物。

49、5、待检物：指特定的目标检测物质，存在于待检样本中，也称为目标待检物。

50、6、分散分布包被：指捕获剂分子以分散或分散分布的方式包被在固相膜上，捕获剂分子之间没有明显的叠加、聚集、重叠和堆积，这与现有的免疫膜层析检测技术中捕获剂通过喷线包被所形成的局部高浓度聚集包被的特征有着显著不同。

51、7、均匀分散分布包被：指捕获剂在固相膜上的包被呈均匀的分散分布的方式。

52、8、梯度分散分布包被：指捕获剂以纵向密度逐渐增加且横向密度均匀分布的方式渐进包被在固相膜上。

53、9、节段性分散分布包被：指捕获剂以片状或分段或零散分布的方式包被在固体膜上。它只覆盖部分固相膜，而不是以一种连续涂覆的方式包被。优选水平密度均匀分布的方式。

54、10.标记物：用指示剂标记的标记产物，也称为检测剂，在本发明中，指化学发光物质作为指示剂标记免疫结合物，形成的化学发光标记物。

55、11.免疫层析法：也称为侧向流检测，是一种旨在通过固相膜反应检测液体样本中待检物的存在或浓度的简单快速的检测方法。