一种高活性腈水解酶突变体的构建方法与流程-ag尊龙凯时

本发明涉及高活性腈水解酶突变体的构建，特别涉及一种高活性腈水解酶突变体的构建方法。

背景技术：

1、烟酸，又名尼古丁酸，是具有生物化学活性的全部吡啶-3-甲酸及其衍生物的总称。烟酸是人类抗糙皮病的重要因子。烟酸的许多酰类化合物还具有降低血脂的作用，增强细胞之间的新陈代谢作用，抑制胆固醇、血浆甘油三酯的形成，具有良好的防治心血管疾病效果。烟酸同时是饲料中的重要添加剂，对家禽的骨骼生长、抗应激反应、产蛋量及种蛋孵化率都有积极作用。在染料工业中。烟酸可以合成多种活染料结合偶氮染料的中间体。烟酸还是pvc塑料和丙烯酰胺聚合的链转移剂的热稳定剂。总之，随着对烟酸及其衍生物在精细化工中的作用的不断深入研究，烟酸的应用日益广泛，重要性也逐渐为人们所认识。

2、目前在工业中，烟酸的化学合成方法主要有：气相氧化法、液相氧化法、电化学氧化法等。化学方法合成烟酸的研究虽然取得了不错的进展，但仍有许多生产中的缺点，而微生物法生产烟酸与化学法相比具有高选择性、高效性、成本低、反应条件温和、环境污染小等优点，逐渐成为研究的热点之一。专利cn202111476802.6通过底物对接确定了催化口袋附近与催化活性相关的位点，利用cast建库nnk突变，通过已构建的烟酸传感器作为初筛工具，利用荧光强度作为筛选依据，采取半理性设计方式提高腈水解酶提高酶pcc6803酶活。但获得的突变菌株对催化生成烟酸酶活较低，不适宜用于工业化生产烟酸。微生物法生成烟酸是利用微生物细胞的腈水解酶催化3-氰基吡啶生成烟酸和氨。目前国内外对于腈水解酶产生菌的研究比较多，但野生型腈水解酶产酶活较低，催化效率低下。因此获得一株高活性腈水解酶菌株，是生物催化法合成烟酸的关键。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高活性腈水解酶突变体的构建方法，通过定点饱和突变技术对腈水解酶基因序列进行分子改造，该突变菌株在提高酶活性的同时，提高对底物3-氰基吡啶耐受性，从而有利于该腈水解酶在烟酸工业制备中的应用，可以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种高活性腈水解酶突变体的构建方法，包括如下步骤：

4、步骤1：构建原始腈水解酶突变体；

5、合成优化密码子的nit序列，连入表达载体pet29a，构建pet29a-nit原始质粒；

6、步骤2：构建腈水解酶点突变体

7、设计点突变引物将氨基酸序列第59位色氨酸点突变为酪氨酸、第166位色氨酸点突变为甘氨酸，第199位缬氨酸点突变为天冬氨酸；

8、步骤3：获得高酶活腈水解酶突变体

9、设计点突变引物饱和突变氨基酸序列第199位缬氨酸。

10、进一步地，腈水解酶基因表达的步骤包括：

11、将高酶活腈水解酶突变体采用大肠杆菌热击转化法导入e.coli bl21(de3)感受态细胞中，分别获得腈水解酶菌株。

12、进一步地，腈水解酶基因表达的步骤还包括：

13、取腈水解酶菌株分别接种于lb液体培养基中37℃培养14小时后，以4％的接种量接入200ml tb培养基中，继续在37℃培养od600＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mm的iptg，在25℃下诱导16小时后离心收集湿菌体，并超声破碎获得粗酶液。

14、进一步地，粗酶液的酶活检测包括如下步骤：

15、取100ul 70g/l三-氰基吡啶溶液和690ul ph7.0 0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液为反应液，将反应液放置在控温30℃混匀振荡器上进行振荡，向其加入10ul处理后的粗酶液，反应10min后加入200ul 0.5mol/l的硫酸溶液终止反应，将反应后的溶液放置在12000rpm的离心机上离心3min。

16、进一步地，磷酸盐缓冲溶液的配制方法包括：

17、称取二水磷酸二氢钠3.04g，十二水磷酸氢二钠10.92g，溶于1l去离子水中。

18、进一步地，计算粗酶液酶活(u/ml)的计算公式如下：

19、

20、其中，c—液相色谱得出的烟酸浓度，μg/ml；

21、v1—反应体积，790μl反应液 200μl硫酸溶液；

22、x—反应进样前的稀释倍数，取6；

23、t—反应时间，10min；

24、v2—所加粗酶液体积，10μl；

25、123.1—烟酸分子量，g/mol；

26、发酵液酶活(u/ml)＝粗酶液酶活×发酵液稀释倍数。

27、进一步地，腈水解酶点突变体催化合成烟酸铵的步骤如下：

28、在1l反应体系中加入v199f菌株6g/l粗酶液，流加45％3-氰基吡啶,流加时间5h，控制反应温度30℃、反应ph7.5，固定转速100rpm，反应生成烟酸铵。

29、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

30、1、本发明通过定点饱和突变技术显著提高腈水解酶酶活，减少催化反应时间，大大降低烟酸生产时间成本。

31、2、本发明可以提高对底物3-氰基吡啶耐受性，可延长酶的使用寿命和稳定性，减少酶的用量，降低生产成本。

技术特征：

1.一种高活性腈水解酶突变体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的高活性腈水解酶突变体的构建方法，其特征在于，腈水解酶基因表达的步骤包括：

3.如权利要求2所述的高活性腈水解酶突变体的构建方法，其特征在于，腈水解酶基因表达的步骤还包括：

4.如权利要求3所述的高活性腈水解酶突变体的构建方法，其特征在于，粗酶液的酶活检测包括如下步骤：

5.如权利要求4所述的高活性腈水解酶突变体的构建方法，其特征在于，磷酸盐缓冲溶液的配制方法包括：

6.如权利要求4所述的高活性腈水解酶突变体的构建方法，其特征在于，计算粗酶液酶活(u/ml)的计算公式如下：

7.如权利要求1所述的高活性腈水解酶突变体的构建方法，其特征在于，腈水解酶点突变体催化合成烟酸铵的步骤如下：

技术总结
本发明公开了一种高活性腈水解酶突变体的构建方法，合成优化密码子的nit序列，连入表达载体pet29a，构建pet29a‑nit原始质粒；设计点突变引物将氨基酸序列第59位色氨酸点突变为酪氨酸、第166位色氨酸点突变为甘氨酸，第199位缬氨酸点突变为天冬氨酸；设计点突变引物饱和突变氨基酸序列第199位缬氨酸。本发明通过定点饱和突变技术对腈水解酶基因序列进行分子改造，该突变菌株在提高酶活性的同时，提高对底物3‑氰基吡啶耐受性，从而有利于该腈水解酶在烟酸工业制备中的应用。

技术研发人员：周浩,刘淑琦,齐勇,王苓,韩道平
受保护的技术使用者：安徽瑞邦生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/20