促进畜禽生长的gm-csf基因与ss基因共表达dna疫苗pires-gm-csf/2ss的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物医药生物工程领域，尤其是一种促进畜禽生长的粒细胞-集落刺 激因子gm-csf基因与生长抑素 ss基因共表达dna疫苗pires-gm-csf/2ss的方法。
【背景技术】
[0002] 对于肉用的动物来说，生长速度、产肉率、饲料利用率等是衡量肉用动物的主要指 标，可以从营养方面调控，也可以从生长发育方面调控。
[0003] 动物的生长轴是由动物体内下丘脑-垂体-靶器官及其相关的激素和受体 所组成的具有自动调节的神经内分泌系统。下丘脑释放生长激素释放因子（growth hormone-releasing factor，grf)、生长抑素（somatostatin，ss)等相关的激素，但是最重 要的是grf和生长激素 （growth hormone，gh)。其中grf是促进垂体释放生长激素，进而 促进动物的生长。而ss则是抑制垂体释放gh，也就是说其具有抑制动物生长的作用。接 着gh又可以直接作用于靶器官，或者通过肝脏分泌的胰岛素样生长因子（insulin-like growth fact〇rs，igfs)再作用于靶器官，这就是动物生长轴的机理。动物的生长受到很多 激素的调节，但是最重要的是grf和ss，含有ss的生长抑素基因疫苗表达产生的抗体中和 内源性ss，间接使grf激素的分泌含量增加，从而促进畜禽的生长；粒细胞-集落刺激因子 (gm-csf)是一种具有多项潜能的造血生长因子，在细胞因子网络中占有重要地位，具有免 疫增强作用，能增强生长抑素 dna疫苗的免疫效果。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种促进畜禽生长的gm-csf基因与ss基因共表达dna疫苗 pires-gm-csf/2ss的方法，该基因疫苗一次注射，能同时表达出ss和gm-csf两个完全独立 的蛋白，从而减少了工作量及对免疫动物的应激影响，能保持独立的免疫原性，增强了免疫 效果。
[0005] 本发明的目的是这样实现的： 一种促进畜禽生长的gm-csf基因与ss基因共表达dna疫苗pires-gm-csf/2ss的方 法，特征是：具体步骤如下： a、 将pires (共表达质粒载体）质粒用i和及i进行双酶切，以pvgs/2ss-asd 质粒为模板，pcr获取猪gm-csf基因，胶回收gm-csf基因与t载体进行连接反应，构建阳 性重组质粒pires-gm-csf ; b、 以pvgs/2ss-asd质粒为模板，用和iii进行双酶切，pcr获取猪ss基因， 用abi i和i进行双酶切与t载体进行连接反应，构建t2ss质粒； c、 采用abi i和i内切酶分别酶切pires-gm-csf质粒和t2ss质粒，将纯化、回收 的pires-gm-csf大片段和2ss片段进行连接反应，构建真核表达质粒pires-gm-csf/2ss， 得到dna疫苗pires-gm-csf/2ss (gm-csf基因与ss基因共表达dna疫苗)。
[0006] pires-gm-csf/2ss疫苗是在真核表达载体pires的mcs a和mcs b两个多克隆位 点分别插入gm-csf和ss基因，在真核动物中可同时独立表达出完全独立的gm-csf和ss 蛋白，可用来促进畜禽生长。
[0007] pires-gm-csf/2ss疫苗采用一次注射，它能同时表达出ss和gm-csf两个完全独 立的蛋白，从而减少了工作量及对免疫动物的应激影响，能保持独立的免疫原性，增强了免 疫效果。
【附图说明】
[0008] 图1为本发明的pires-gm-csf/2ss质粒的构建图。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。
[0010] 一种促进畜禽生长的gm-csf基因与ss基因共表达dna疫苗pires-gm-csf/2ss 的方法，具体步骤如下： 1共表达基因疫苗pires-gm-csf/2ss的构建及鉴定方法(技术路线见图1) 1.1引物的设计与合成 采用primer 5. 0软件设计引物，分别根据猪的gm-csf序列和2ss片段(含有乙肝表面 抗原s基因）序列设计扩增gm-csf和2ss片段的引物(见表1)，设计引物由上海生物工程 有限公司合成。
[0011] 1.2 pires质粒的提取与酶切 将pires质粒转入感受态大肠杆菌a cwi dh5a中，铺板与扩大培养后挑取单菌落进 行培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒pires，然后进行酶切，酶切体系为：10 xm buffer 1. 0 μ l、zaa i 0· 2 μ l、方cor i 0· 2 μ l、pires 质粒 2 μ l、ddh20 至总体积 10 ul，37 °c，反应2-3 h，酶切后，用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
[0012] 1. 3 pires-gm-csf 质粒的构建 1.3. 1 gm-csf基因的扩增 按试剂盒说明书抽提和纯化pvgs/2ss-asd质粒。以pvgs/2ss-asd质粒为模板，按照 如下pcr反应体系进行gm-csf基因的扩增：5xbuffer 2 yl、d ntp 0. 4 yl、taq dna聚 合酶 0.4 yl、引物 pl、p2 各 0.5 yl、pvgs/2ss-asd质粒 l5 yl、ddh20 至合计 20 yl。 按以下条件进行pcr反应：94 °c变性6 min，然后，94 °c变性1 min、51 °c退火1 min、72 。(:延伸1 min，35个循环后72 °c续延10 min、16 °c降温5 min。pcr产物1.0 %琼脂糖电 泳检测，胶回收，纯化和定量，备用。
[0013] 1. 3. 2 gm-csf基因与t载体相连 按照如下连接体系将gm-csf基因与t载体进行相连：pcr的产物gm-csf 4 μ l、t-载 体1 yl，35 °c反应15 min，将反应产物转化感受态dh5a中，培养后，采用质粒提取试剂盒 提取质粒tgm-csf质粒。然后按以下酶切体系进行酶切鉴定：t-gmcsf质粒2 i 0.1 yl、方cor i 0.3 yl、10x m buffer 1 yl、加 dd h20 至总体积 10 yl，鉴定正确的 质粒送往北京奥科生物技术有限公司测序，备用。
[0014] 1.3.3 pires-gm-csf 质粒的构建 纯化后的pires质粒和tgm-csf质粒分别用船e i和i双酶切，酶切体系分别为： pires 质粒 12 i 0.4 yl、此or i 0.8 yl、10xm buffer2 yl、加 dd h20 至总 体积20 yl;tgm-csf 12 μl、λ*??ι 0.2 yl、方cor i 0.2 yl、10xm buffer 2 yl、加 dd h20至总体积20 μ l，37 °c，反应2-3 h，酶切后，用1.0 %琼脂糖凝胶电泳，分别分离回收 pires大片段和gm-csf片段，备用。
[0015] 然后，将回收、纯化的pires大片段和gm-csf片段按如下体系进行连接反应： pires 载体线性片段 1 yl、gm-csf 线性片段 4 yl、5xt4ligasebuffer2 yl、t4dna ligase 1 yl、ddh20 2 yl、共计 10 yl，23°c 水浴，连接 20min〇
[0016] 1· 3· 4阳性重组质粒（pires-gm-csf)的筛选和鉴定 将连接产物转化感受态a cwi dh5a细菌，固体培养基铺板培养，挑取阳性克隆，lb培 养，提取质粒dna，进行酶切鉴定，酶切体系为：阳性克隆2 i 0. 1 yl、此〇r i 0.3 yl、10xm buffer 1 yl、dd h20 至总体积 10 yl，37 °c，反应 2-3 h，1.0 % 琼脂糖 电泳检测，电泳条带与目的条带大小相符，鉴定正确的质粒送往北京奥科生物技术有限公 司测序，获得的阳性克隆命名为pires-gm-csf。
[0017] 1. 4 pires-gm-csf/2ss 质粒的构建 1.4. 1 2ss基因的扩增 以pvgs/2ss-asd质粒为模板，按照如下pcr反应体系进行ss基因的扩增：5xbuffer 2 yl、dntp0.4 yl、taqdna 聚合酶 0.4 yl、引物 p3、p4 各 0.5 yl、pvgs/2ss-asd 模板1. 5 μ l、ddh20至总体积20 μ l，按以下条件进行pcr反应：94 °c变性6 min，然后 94 °c 变性 1 min、54.9 °c 退火 1 min、72 °c 延伸 1 min，35 个循环后，72 °c 续延 10 min、 16 °c降温5 min，pcr产物1. 0 %琼脂糖电泳检测，胶回收，纯化和定量，备用。
[0018] 1.4.2 t2ss质粒的构建 将2ss的pcr产物与t