1.本发明属于医药领域，涉及一种高效农药递送体系的制备方法。
背景技术：
2.尽管农药的使用被认为是确保农产品高产优质的重要贡献之一，但过量使用农药可能会对环境质量和人类健康造成无法控制的风险。由于多种环境因素和多种施用方式，通常用于植物表面的农药只有很少一部分会进入植物体内。目前在包括材料科学以及农业研究在内的多个领域中探索纳米颗粒。在农药的使用效率方面，纳米粒子有望成为重要的工具，可高效地将农药运输到植物目标组织。但是，到目前为止，人们对纳米粒子通过植物细胞屏障以及纳米颗粒与植株生物过程的相互作用知之甚少。
3.传统的农药配方存在利用率低、非靶向施药的严重缺点，并且由于挥发、喷药漂流、径流、光解、微生物降解等问题，这些常规农药在使用过程中90％以上会流失到周围环境中，是严重的浪费，对环境也会存在污染。
技术实现要素：
4.本发明提供一种介孔二氧化硅-低共熔溶剂-吐温(msns-des-tween,mdt)的高效农药递送体系的制备方法，通过介孔二氧化硅共价连接柠檬酸，然后与氯化胆碱和一水柠檬酸形成低共熔体系，该体系中的介孔二氧化硅纳米颗粒不会聚集，能充分增大介孔二氧化硅纳米颗粒的分散性，并成功渗透进植物叶片内。
5.本发明具体技术方案如下：
6.一种介孔二氧化硅-低共熔溶剂-吐温的高效农药递送体系制备方法，具体步骤如下：
7.在50ml质量分数2％的2-吗啉乙磺酸缓冲液中加入1mol一水柠檬酸，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)800mg和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)1000mg进行羧基活化2h，再加入0.8-1g氨基化修饰的二氧化硅纳米粒子(msns-nh2)反应24小时，12000rpm离心洗涤分离得到沉淀camsns，按照camsns:氯化胆碱:一水柠檬酸质量比为1:9-28:14-15的比例，称取氯化胆碱和一水柠檬酸，将三者混合，再加入1ml的h2o，混合物加热到85-90℃，保温搅拌至溶液澄清时，将溶液在50℃下旋蒸得到粘稠性液体即为介孔二氧化硅-des，最后用制备的介孔二氧化硅-des与乳化剂按体积比为1:1-3混匀，得到高效农药递送体系，装入玻璃样品瓶，将其放于干燥器中干燥备用，防止暴露空气中吸水从而影响后续实验，用时直接用滴管吸取即可。
8.所述氨基化修饰的二氧化硅纳米粒子的制备方法如下：将1g介孔二氧化硅纳米颗粒加入到50ml甲苯中，110℃加热搅拌分散均匀，逐滴加入1.2ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在110℃下回流24小时，反应结束后，分别用乙醇和水洗涤三次，离心分离并冷冻干燥得到氨基化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子；所述介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径为50-100nm，形貌为球状，有明显孔道结构，介孔二氧化硅纳米颗粒可以市场购买得到或者通过常规方法
制备得到。
9.所述乳化剂为吐温-20、吐温-80、聚乙二醇中的一种。
10.本发明用一种新的方式把介孔二氧化硅高度分散在低共熔体系里来考察二氧化硅透过植物叶片的能力，介孔二氧化硅纳米颗粒具有优秀的物理化学性质，如可控的多孔结构和孔隙大小、成分、形貌，易于表面化学修饰和良好的分散性，高客体分子装载量和优良的生物相容性，并且结构稳定可以保护客体分子不被破坏降解等，因此用介孔二氧化硅纳米颗粒做药物载体是一个不错的选择。
11.本发明的有益效果：
12.本发明通过对介孔二氧化硅纳米颗粒共价连接柠檬酸，再与氯化胆碱和一水柠檬酸通过氢键作用形成低共熔体系，增大了介孔二氧化硅的分散性，提供了一种纳米颗粒高效渗透递送农药新的药剂学策略，在长效持续型纳米农药制备、开发新型环保农药方面具有潜在的应用前景。
13.相较传统农药的喷施、浇灌等用药途径，本发明纳米颗粒高效渗透的平台建立具有更加安全，可控，药物生物利用度提高等优势。
14.本发明提供了一种固体纳米颗粒高效渗透递送农药进入植物体新的药剂学策略，在长效持续型纳米农药制备、开发新型环保农药方面具有潜在的应用前景。
附图说明
15.图1实施例1的五种des对纤维素半纤维素溶解度图；
16.图2实施例2的des与不同乳化剂的混合图
17.图3实施例2的des与不同比例吐温-80混合图；
18.图4实施例2的介孔二氧化硅纳米颗粒的透射电镜(tem)图
19.图5实施例2的msns、msns-nh2、camsns的红外光谱图；
20.图6实施例3的载丙环唑camsns药物累积释放量；
21.图7实施例4的叶片3d荧光图。
具体实施方式
22.下面通过实施例和附图进一步阐述本发明的实质特点，但本发明的保护范围绝非仅局限于实施例。
23.实施例中使用的介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径为50-100nm，形貌为球状，有孔道结构，介孔二氧化硅纳米颗粒通过常规方法制备得到或者市场购买得到
24.实施例1
25.des的结构功能关系对木质素和半纤维素提取的影响可能是影响des对植物渗透性的一大因素，des提取木质素和半纤维素的性能受诸多因素的影响，如提取温度、des类型、hba/hbd摩尔比等，在这些因素中，des组分中官能团的质量和数量影响最大，des通常通过混合天然和可再生成分来制备，这决定了合成des的性质及其在从生物质中分离木质素过程中的行为。
26.挑选出五种des，以氯化胆碱和乳酸、苹果酸、柠檬酸分别制备des，表示为chcl-la、chcl-ma、chcl-ca，摩尔比分别为10:1、3:1、3:1；以甜菜碱、精氨酸和柠檬酸制备des，表
示为bet-ca、arg-ca，摩尔比均为3:1，用所挑选的五种des进行木聚糖、木质素、纤维素的溶解性实验；实验结果如图1所示，五种des对木聚糖、木质素、纤维素的溶解各有不同，其中chcl-la组对三种溶解对象均呈现较好的溶解，chcl-ma组对于木聚糖与木质素溶解度分别第二与第三；chcl-ca组对于木聚糖和木质素溶解度呈第三和第二，处于中间水平；其余两组对三种溶解对象的溶解均呈现较差的溶解。综合考量下来，选择各项目溶解度较为温和的des(chcl-ca)进行后续实验；植物细胞壁是一种天然的纳米级网络结构，主要由纤维素、半纤维素和果胶等多糖聚合物组成，其中还包含糖蛋白和木质素，在主要的细胞壁成分中，半纤维素最容易发生化学降解，所以本实施例说明选定的des能够溶解木聚糖、木质素和纤维素。
27.实施例2
28.制备介孔二氧化硅-低共熔溶剂与不同乳化剂和不同乳化剂比例的体系，考察介孔二氧化硅-des-tween体系的稳定性，具体步骤如下：
29.(1)将1gmsns加入到50ml甲苯中，110℃搅拌使其分散均匀，然后110℃逐滴加入1.2ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，滴加完毕之后在110℃下回流24小时，反应结束后，分别用乙醇和水洗涤三次，离心分离并冷冻干燥得到氨基化修饰的二氧化硅纳米粒子(msns-nh2)；
30.(2)称取2-吗啉乙磺酸(mes)0.9762g，加入水50ml，再加入1mol一水柠檬酸(ca)，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)800mg和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)1000mg，羧基活化2h，再加入1g步骤(1)制备的msns-nh2反应24小时，12000rpm洗涤离心分离得到沉淀camsns；
31.(3)按照camsns:氯化胆碱:一水柠檬酸质量比为1:28:14的比例，称取氯化胆碱和一水柠檬酸，将三者混合，再加入1ml的h2o，混合物加热到85-90℃，保温搅拌至溶液澄清时，将溶液在50℃下旋蒸2min得到粘稠性液体，最后装入样品管，将其放于干燥器中干燥备用；
32.(4)取步骤(3)制备好的介孔二氧化硅-低共熔溶剂按照体积比1:1分别与吐温20、吐温80、聚乙二醇混合形成体系，随后挑选出混合均一的体系再按照介孔二氧化硅-低共熔溶剂：乳化剂体积比1:1、1:2、1:3建立体系，最后装入样品管中，放置于干燥器中备用，使用时用滴管取即可。
33.实验结果与分析：如图2所示，制备好的低共熔溶剂与三种不同乳化剂混合后呈现不同的状态，从左至右分别是吐温20、吐温80、聚乙二醇，其中与吐温20和peg混合后静置一段时间出现分层现象，与吐温80混合静置后不会出现分层现象，混合比较均一，说明与吐温80混合较好；挑选出混合均一的体系(介孔二氧化硅-低共熔溶剂与吐温80的体系)进行不同混合比例实验，如图3所示，按照介孔二氧化硅-低共熔溶剂:乳化剂吐温80体积比1:1、1:2、1:3(图中从左至右)建立的体系状态均一并且稳定无分层现象，其中介孔二氧化硅-低共熔溶剂:乳化剂吐温-80体积比1:3所建立的体系对叶片既保持了良好渗透性又对叶片伤害较弱。
34.表征：
35.(1)透射电镜tem测定：
36.tem检测设置参数：电子枪：lab6(六硼化镧)点分辨率：0.23nm线分辨率：0.14nm加
速电压：200kv束斑尺寸：1.0～25nm放大倍数(高倍)：2000～1500000放大倍数(低倍)：50～6000倾斜角：
±
35
°
，能谱仪技术指标：能谱仪能量分辨率(mnk)：优于136ev分析元素：5b～92u。
37.实验处理与结果分析：将本实施例步骤(1)的介孔二氧化硅纳米粒子(msns)在水中超声分散，然后取少许液体经制样—合轴—拍形貌对纳米颗粒分析，如图4所示，二氧化硅纳米颗粒为球状，粒径在50-100nm之间，颗粒有明显的孔道结构；实施例最后所建立的体系的tem图与图4一致，都可以看到球状二氧化硅和孔道结构。
38.(2)傅里叶红外光谱测定：
39.通过干燥溴化钾压片法测定msns，msns-nh2，camsns的傅里叶红外光谱。
40.实验结果分析：如图5所示，msns的特征吸收峰有3435cm-1
的o-h峰，1093cm-1
和796cm-1
的si-o-si峰，964cm-1
的si-o峰；msns-nh2的特征吸收峰为1550cm-1
的n-h峰；camsns的特征吸收峰有1710cm-1
的酰胺i带，1627cm-1
的酰胺ii带，1398cm-1
的酰胺iii带。
41.按照camsns:氯化胆碱:一水柠檬酸质量比为1:9-28:14-15的比例进行实施例2的操作，也可以得到与实施例2相同的结果，得到高效农药递送体系。
42.实施例3
43.制备装载丙环唑的共价连接柠檬酸介孔二氧化硅，考察共价连接柠檬酸介孔二氧化硅的药物释放能力，具体步骤如下：
44.(1)将1g msns加入到50ml甲苯中，110℃搅拌使其分散均匀，然后110℃逐滴加入1.2ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，滴加完毕之后在110℃下回流24小时，反应结束后，分别用乙醇和水洗涤三次，离心分离并冷冻干燥得到氨基化修饰的二氧化硅纳米粒子(msns-nh2)；
45.(2)称取2-吗啉乙磺酸(mes)0.9762g，加入水50ml，再称取一水柠檬酸(ca)1mol加到mes溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)800mg和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)1000mg，羧基活化2h，加入0.8g步骤(1))制备的msns-nh2反应24小时，12000rpm离心分离得到沉淀camsns，冷冻干燥后放置在样品瓶中；
46.(3)取200mg camsns和20ml含丙环唑原药1mg/ml的正己烷一起置于锥形瓶中，设置摇床速度200rpm进行摇晃，避光包载24h，包载完成后，过滤之后置于37℃干燥24小时，用紫外分光光度计检测并计算载药量，随后干燥保存。
47.载丙环唑纳米粒子药物释放实验：
48.准确称取包载丙环唑的camsns30mg溶于10ml pbs缓冲液中，进行药物释放，取样时间点为1h，6h，12h，24h，36h，48h，96h，120h，每次取2ml pbs液体后加入2ml新鲜pbs液体，通过紫外分光光度计在270.8nm激发波长下测定每个时间点的药物浓度，并绘制药物释放曲线，如图6所示，可看包载丙环唑原药的camsns在120h时释放出了60％左右的丙环唑原药，持续释放效果较好。
49.实施例4
50.制备装载异硫氰酸荧光素的mdt体系，考察mdt体系的渗透皮能力，具体步骤如下：
51.(1)将16g氯化三甲基十六烷基铵(ctac)溶解于200ml去离子水中，加热到95℃，搅拌溶解，加入溶解于荧光材料，荧光材料是10mg fitc荧光染料溶于3ml乙醇得到，然后加入0.5ml三乙醇胺(tea)，继续搅拌1小时，接着逐滴加入12ml正硅酸乙酯(teos)，继续反应1小
时，直至产生乳黄色悬浮液，于12000rpm离心分离得到沉淀；
52.(2)步骤(1)的沉淀于100ml盐酸/甲醇的混合溶液(1:4体积比)中回流8小时，再离心分离，得到沉淀，重复以上回流操作三次，即可去除模板剂ctac，最后得到的沉淀用乙醇和去离子水分别洗三次，离心并冷冻干燥得到装载fitc荧光染料的介孔二氧化硅纳米粒子(msns(fitc))；
53.(3)将1g(msns(fitc))加入到50ml甲苯中，110℃搅拌使其分散均匀，然后110℃逐滴加入1.2ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，滴加完毕之后在110℃下回流24小时，反应结束后，分别用乙醇和水洗涤三次，离心分离并冷冻干燥得到氨基化修饰的二氧化硅纳米粒子(msns(fitc)-nh2)；
54.(4)称取2-吗啉乙磺酸(mes)0.9762g，加入水50ml，再称取一水柠檬酸(ca)1mol加到mes缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)800mg和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)1000mg，羧基活化2h，加入0.8g步骤(3)制备的(msns(fitc)-nh
2)
反应24小时，12000rpm洗涤离心分离得到沉淀(camsns(fitc))；
55.(5)按照(camsns(fitc)):氯化胆碱:一水柠檬酸质量比为1:28:14的比例，称取氯化胆碱和一水柠檬酸，将三者混合，再加入1ml的h2o，混合物加热到85-90℃，保温搅拌至溶液澄清时，将溶液在50℃下旋蒸2min得到粘稠性液体，最后用制备的介孔二氧化硅(fitc)-des:吐温80按体积比1:3混合得到装载异硫氰酸荧光素的mdt体系，最后装入样品管，将其放于干燥器中干燥备用，用时直接用滴管吸取即可。
56.植物叶片渗透实验：
57.使用叶片为8-12周盆栽玉米叶片，取20mgmsns(fitc)分散于1ml水(编号ⅰ)、20mgmsns(fitc)分散于1ml吐温80(编号ⅱ)、20mgmsns(fitc)分散于1ml制备好的des(chcl:ca摩尔比3:1)(编号ⅲ)作对照组，取保存在干燥器中的装载异硫氰酸荧光素的mdt体系1ml作实验组(编号ⅳ)，均滴加到固定好的叶片上，温度控制在室温，计时开始后，取样时间点为1h，6h，12h，24h，48h，取样后用去离子水冲洗制样，最后通过激光共聚焦显微镜在激发波长488nm下，拍摄条件均相同时扫描拍摄叶片3d荧光图，由于在制备介孔二氧化硅的初期就加入了fitc，所以fitc不易从纳米颗粒中泄漏出来，这样测出了荧光就代表了有二氧化硅的存在；结果如图7所示，可以看出相较实验组，对照组所检测到的荧光零星并且较弱，并且各组别荧光随时间的推移逐渐增强。
58.本发明将柠檬酸共价修饰连接到氨基修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒上，并与氯化胆碱和一水柠檬酸共同反应，制备了mdt体系，使msns高度分散在des内部，通过纤维素半纤维素溶解实验，傅里叶红外光谱仪、紫外分光光度计、透射电镜、激光共聚焦显微镜来综合分析介孔二氧化硅-低共熔溶剂-吐温体系稳定性、持续给药的能力，且具备高效渗透叶片能力。
59.目前尚未有固体纳米颗粒渗透入叶片给药的研究，本发明提供了一种固体纳米颗粒在植物叶片上高渗透给药的新药剂学策略，在长效循环纳米农药制备、绿色纳米农药开发方面具有潜在的应用前景。