专利名称：一种小麦抗旱基因taasr1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种小麦抗旱基因taasrl，并且涉及taasrl基因在提高植物抗干旱能力中的各种应用。
背景技术：
植物是固着底栖生物，必须适应环境才能存活，所以非生物应激反应对植物有着非常重要的作用。非生物逆境包括光、高温或低温、冷冻、干旱、盐度、重金属和缺氧等复杂环境条件引起的胁迫。由于全球气候变化，这些非生物逆境正在影响植物的生存环境且影响会不断增加。植物为了适应其生长环境，经过长期进化产生了对非生物逆境胁迫的防御机制，这些防御机制的发生和传递涉及到多种基因的参与。编码转录因子蛋白的基因是一类参与植物逆境胁迫的重要基因。1993年aba-胁迫-成熟响应蛋白基因(asrl)作为一种干旱胁迫诱导的基因首次从番爺中分离得到iusem nd, bartholomew dm, hitz wd and scolnikpa(1993)tomato(lycopersicon esculentum)transcript induced by waterdeficit andripening.plant physiol.102,1353-1354.,此后对这类基因的研究广泛开展。研究发现asr基因在植物中广泛存在，到目前为止已经在土豆、玉米、柚子、火炬松、百合花、水稻、葡萄中分离到asr基因，但是在模式植物拟南芥中尚未发现asr基因carrari f，fernie arandlusem nd (2004)heard it through the grapevine aba and sugar cross-talk:theasr story.trends plant sc1.9, 57-59.。通过亚细胞定位检测,asrl蛋白在细胞核中表达。酵母单杂交实验证明这类蛋白可以与dna结合，推断asr蛋白可能是一类转录因子。现有的研究表明，植物asr基因能够被干旱、高盐、冷等环境胁迫诱导，并且参与aba信号途径。在甘蔗中分离出的asr基因sodip22只存在于表皮细胞中，在aba及干旱处理条件下，其表达量显著被诱导；在银杏中也克隆到了 asr基因，通过高盐、甘露醇和aba处理，在根、茎、叶的表达量明显上升。另外，过表达asr家族基因能够显著提高植物对冷、干旱、盐等非生物逆境的耐受性。在百合中证实asr蛋白的积累与花粉管的干燥作用密切相关，并且从百合中克隆了 asr基因lla23，表达分析表明该基因受aba、nacl和干旱诱导，在拟南芥中过表达该基因能够明显提高植物对高盐的耐受性yang cy, chen yc, jauh gy and wangcs.(2005)a lily asr protein involves abscisicacid signaling and confers droughtand salt resistance in arabidopsis.plant phys iol.139,836-846.。小麦是世界上最早栽培也是最为重要的粮食作物之一。世界上有40多个国家以其为主食，占世界总人口的35%。各国政府和科学家历来都非常注重小麦的遗传规律和遗传改良的研究。改良小麦品质、提高产量和增加抗性一直是作物改良研究的重点。转录调控是基因表达调控的重要方式之一。转录因子具有和顺式作用元件结合，调控下游多个基因表达的特点。所以，找到小麦品质、抗性相关的转录因子，利用基因工程的方法提高其表达水平从而调控相关的下游基因的表达，是提闻小麦品质、抗性较为有效的方法。asr基因作为一个转录因子在植 物中广泛存在，其功能主要涉及到植物对非生物条件(光、水、温度)胁迫的响应。但在小麦中尚未见asr基因的报道。因此，克隆和鉴定小麦中的asr基因对提高小麦抗逆性理论研究和实际运用有着重要的科研及应用价值。
发明内容
本发明目的在于提供一种分离的小麦aba-胁迫-成熟响应蛋白以及编码该蛋白的基因，本发明中也称其为小麦抗旱基因(taasrl)，本发明还提供该基因在培育高抗旱性植物中的应用。实现本发明的技术方案是:本发明提供的分离的小麦aba-胁迫-成熟响应蛋白的氨基酸序列为:(i)由seq id n0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(2)与序列seq id n0.2限定的氨基酸序列同源性在80_100%编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或(3) seq id n 0.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的由(i)衍生的蛋白。编码上述蛋白的基因属于本发明的范围，本发明列出了编码上述分离的小麦aba-胁迫-成熟响应蛋白的基因(小麦抗旱基因taasrl)的一个核苷酸序列,该核苷酸序列如seq id n0.1所示。本发明提供的编码小麦aba-胁迫-成熟响应蛋白的基因、含有该基因的表达载体和导入有该表达载体的宿主，可用于培育高抗旱性植物，如培育高抗旱性烟草。本发明利用数据库中的est序列及race技术相组合，通过各种生物信息学预测手段，获得一种aba-胁迫-成熟响应蛋白基因全长为414bp的cdna序列，ncbi登录号为:hq287799，其核苷酸序列如seq id n0.1所示。该基因共编码137个氨基酸的蛋白，预测分子量为15.3kda，其氨基酸序列如seq id n0.2所示。序列比对分析表明，该基因所编码的氨基酸序列具有两个典型的保守区域、aba/wds保守结构域、一个his富集区域和两个ala富集区域。因此，该基因属于典型的aba-胁迫-成熟响应蛋白家族，是小麦中一个新的asr基因。应该明确的是，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其蛋白生物活性的前提下，对其实施取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸，蛋白质序列比对同源性在95%以上，所得到所述蛋白的突变体序列。因此，本发明，还包括对seq id n0.2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸，得到的高同源性且具有生物活性的衍生蛋白。本发明基因包括编码上述所述蛋白的核苷酸序列。此外，应当理解，鉴于密码子兼并性及物种具有密码子偏好性的特点，本领域技术人员，可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本发明的基因和蛋白质可以从小麦品种中国春中克隆或分离得到，或者通过序列化学合成方法得到。可将本发明基因连接至表达载体启动子下游，构建能够表达该蛋白的重组表达载体，进而可以通过遗传转化的方法，将所述表达载体导入各种宿主，得到转taasrl基因的转化体。
本发明将小麦抗旱基因taasrl导入烟草，转基因植株的抗旱表型及抗旱生理指标，均得到显著性提高，表明taasrl基因可用于提高作物抗旱性。本发明技术路线如下:查询获得小麦est —小麦材料处理一目的基因扩增一基因表达分析一实验载构建一转基因植物抗逆表型及生理分析一研究结论
图1小麦抗旱基因taasrl所编码氨基酸的多序列比对及保守区说明(注:方框代表aba/wds模体；星号代表豆蘧酰化位点；双横线表不可能的核定位信号)。图2taasrl基因在不同组织(a)及peg6000⑶、aba(c)、双氧水⑶处理下的表达分析(注:r,根；s，茎；l,叶；st,雄蕊；p,雌蕊；le,外稃)。图3烟草过表达载体pcambia1304_taasrl构建示意图。图4转taasrl基因烟草表型分析(注:wt为野生型，vc为转空载体植株，oe为taasrl过表达株系；a为六周幼苗，b为三周幼苗，c为存活率计算)。图5转taasrl基因烟草种子萌发率及根长分析(注:wt为野生型，vc为转空载体植株，oe为taasrl过表达株系；a为各株系在ms上生长8天的照片；a为各株系在ms上生长8天的发芽率统计；b为各株系在ms 150mm甘露醇培养基上生长8天的照片；b为各株系在ms 150mm甘露醇培养基上生长8天的发芽率统计；c为各株系在ms 300mm甘露醇培养基上生长8天的照片；c为各株系在ms 300mm甘露醇培养基上生长8天的发芽率统计；d为一周大的幼苗在ms上生长一周后的根长图片；e为一周大的幼苗在ms 150mm甘露醇培养基上生长一周后的根长·图片；f为一周大的幼苗在ms 300mm甘露醇培养基上生长一周后的根长图片；g为各株系在ms、ms 150mm甘露醇、ms 300mm甘露醇上生长一周后的根长统计)。
具体实施例方式实施例1小麦抗旱基因taasrl的克隆及生物信息学分析小麦的表达序列标签序列(est)可通过dfci小麦数据库进行查找(http://compbi0.dfc1.harvard, edu/cg1-bin/tgi/gimain.pi gudb = wheat)。从这一数据库中，我们发现三个est序列(bf414974，ca695407, dr734766)属于aba-胁迫-成熟响应蛋白(asr)家族，并且编码同一个asr蛋白，具有保守的aba/wds结构域。序列分析表明，这三个est所编码的蛋白的5’ -端是完整的，但是3’ -端缺失。利用race技术，我们获得了该est序列的3’-端。通过序列拼接及pcr扩增，我们获得了该基因的完整序列，将其命名为taasrl，如seq id n0.1所示。利用blast、orffinder、dnaman等数据库或者软件分析表明，我们所获得的taasrldna包含了完整的开放阅读框(orf)。通过多序列比对分析确定该基因所编码蛋白具有asr家族蛋白所具有的保守结构域及活性区域(图1)。在序列n端具有一个典型的能够和锌结合的六个组氨酸残疾；在序列c端具有两个个典型的亮氨酸富集区，一个aba/wds结构域和一个推断的核定位信号(见图1)。这些结果表明，我们所获得taasrl是一个新的小麦asr成员，为该基因的功能研究奠定了基础。实验步骤:
1.引物设计:根据获得的est片段用primer premier5设计一条race引物plup:5’ -gaagcacgaggcgaagaaggaccc-3’，race 反应的接头引物为 pldown:5’ -ctaatacgactcactatagggc-3’。2.反应体系:在0.2ml离心管中依次加入cdna模版l.0ul, 10xbuffer2.5u l,dntp0.5 ii l, plup (iopm) 1.0ii l, pldown (iopm) 1.0ii l, taq 聚合酶(5u/u l) 0.3 u l,ddh2018.7u l03.反应程序:94°c,5m ；94°c,30s ；48°c,30s ；72°c,30s ；72°c, iom ;35cycle。
4.目的片段的回收:用tiangen的琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收(参照说明书)。5.回收产物与pmd18-t vector连接(参照takara说明书):在0.2ml离心管中依次加入 pmd18_t vector (50ng/u l) 0.5 u l,回收产物(loong/ u l) 3.0 u l, solut ion15.5ul, ddh201.0ii l。混匀后瞬时离心，将管壁上的液滴收集到管底，16°c连接12小时。6.e.col i dh5 a感受态细胞的制备:参照分子克隆实验指南(黄培堂2002)。7.连接产物转化e.coli dh5 a:参照分子克隆实验指南(黄培堂2002)。8.重组质粒dna的小量提取:参照分子克隆实验指南(黄培堂2002)。9.重组质粒的pcr鉴定:pcr反应体系同实例1.2，反应程序同实例1.3。10.重组质粒双酶切鉴定及测序:在0.2ml离心管中加入重组质粒(900ng/u l)5.0u l, ecor i (15u/ u l) 1.0u l, hindiii (15u/ u l) 1.0u l, 10xbufferk2.0u l,ddh2013.0ii l，混匀后，稍稍离心，37°c温浴3h，然后将酶切产物在i %琼脂糖凝胶中电泳，与pcr鉴定结果结合分析判断是否有相应的片段插入。测序由上海生物工程有限公司完成。11.taasrlcdna 全长克隆(i)引物设计:p2up:5-tcagccggcggccatggcggagg-3 ；p2d0wn:5_gtgatctagccgaagtggtggt-3。(2)反应体系:在0.2ml离心管中依次加入cdna模版l.0ul, 10xbuffer2.5 u l,dntp0.5 u l, p2up (iopm) 1.0 u l, p2d0wn (iopm) 1.0 u l, taq m 合酶(5u/u l) 0.3 u l,ddh2018.7u l0(3)反应程序:94°c,5m ；94°c,45s ；52°c,45s ；72°c,45s ;72°c，iom ;35 循环。(4)目的片段的回收、连接、转化、质粒提取、鉴定、测序:操作同实例i的4-10。实施例2基因的表达分析实验步骤:1.实验材料的处理:受试的逆境及各种信号分子处理的小麦品种为中国春(triticum aestivum l.cv.chinese spring)。上述种子经过消毒除菌程序后,在洁净培养皿中，以无菌水为培养液得到萌发种子，将其种至ms培养基上，在16/8光周期，25°c温度条件下培养得到籽苗。特殊逆境模拟处理以生长10日大的籽苗为对象进行处理。(i) peg模拟干旱处理:籽苗移栽至含20% peg6000溶液的培养液培养24小时，分别在处理2，6，12，24小时，时间点取样，液氮冻存。(2)信号分子处理:籽苗叶片喷施100 u m脱落酸，iomm双氧水24小时，分别在处理2，6，12，24小时，时间点取样，液氮冻存。
(3)组织表达处理:对于上述处理材料，剪取幼苗根，茎，叶和花的雌蕊，雄蕊和外稃部分，液氮冻存。2.处理样品的rna提取:利用天根生物科技公司所提供的植物组织rna提取试剂盒进行rna的提取。按照其说明书进行规范操作。通过琼脂糖凝胶电泳检测所提取的rna的完整性。3.rna的反转录:利用ferments反转录试剂盒将rna反转录成cdna反转录步骤如下:(i)加入总rna0.lng-5 u g, oligo (dt) 18弓丨物iul并用双蒸水补充至12 u i,混匀离心后在65°c水浴锅中温育5min,然后立即放于冰上冷却。(2)加入反应 buff er4 u i, rnase inhibitor i u i, iomm dntp mi x2 u i, m-mulv 反转录酶(200u/ii i) u i,混合离心，42°c水浴锅中温育60min。(3) 70°c灭活 5min。4.实时荧光定量pc r(qrt-pcr)引物设计:引物设计在非翻译区，排除了基因所编码蛋白的保守区域。引物所扩增的产物进行了测序分析证实该引物的可靠性。p3(taasrl)up:5' -gctgtcctactggtcgcata-3'p3(taasrl)down:5' -aacggtgatctagccgaagt-3'p4(taact i n)up:5' -tgctatccttcgtttggacctt-3'p4 (taact i n) downj' -agcggttgttgtgagggagt-3'5.实时荧光定量pcr (qrt-pcr)条件探索:将获得的一个cdna模版按浓度梯度10倍稀释6个梯度进行qrt-pcr分析，得到ct值与浓度梯度的函数关系。根据斜率计算出引物的扩增效率。6.qrt-pcr进行相对表达分析:每个样品同时扩增目的基因(taasrl)及内参基因(taactin)，并设置四次技术重复。按照94°c预变性3min，94°c变性10s，55°c退火10s，72°c延伸30s，共40个循环的反应程序进行扩增(四个基因的反应程序是一致的)，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94°c_55°c的融解曲线分析。将扩增获得的ct值利用2-a act方法进行计算，并以未处理的对照样品为基准进行比较。a act = (ct，target-ct, actin) time x- (ct, target-ct, actin) timeo0在本实施例中，培养10天的小麦幼苗经peg6000、aba和双氧水处理后采集其叶片组织，提取rna，反转录为cdna作为模板。并且，采集不同组织的样本提取rna，反转录为cdna作为模板。采用sybr i为荧光染料，建立qpcr反应体系，进行表达分析(见图2)。结果表明，该基因在小麦根、茎、叶、雄蕊、雌蕊和外稃中都有表达，在根中的表达量最高。而且，该基因能够被渗透胁迫(peg6000)、aba和双氧水显著诱导。这些结果表明，该基因可能参与逆境胁迫响应，为随后进行该基因抗逆功能的鉴定提供了可行的依据。实施例3植物表达载体的构建构建步骤:1.目的基因的pcr扩增:根据taasrl的cdna序列用primer premier5设ii 对引物，进行pcr扩增。p5up: catgccatggcggaggagaagcaccaccp5d0wn:ggactagtgccgaagtggtggtgcttct
扩增程序和反应体系同实例i之步骤11。2.目的片段的回收:同实例i之步骤4。3.目的片段的酶切:在0.2ml离心管中加入回收的目的片段20 u l，nco i (iou/u l)4u l, spe i (lou/ u l) 4 u l, iox buffer k 0.1 % bsa5 5 y l，/k 12 u l。4.目的片段的再次回收:同实例i之步骤4。5.pcambia1304载体的获得:将保存在大肠杆菌中的pcambia1304质粒提取出来，提取方法同实例i之步骤8。参照实例3之步骤3方法对质粒进行酶切，酶切后的质粒用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，方法同实例i之步骤4。6.目的片段和pcambia1304载体的连接:pcambia1304载体3 y l，目的片段3 y l，t4dna连接酶(350u/ii l) i u l，t4bufferl u l,ddh202ulo混匀后瞬时离心，将管壁上的液滴收集到管底，16°c连接12小时。7.感受态的制备、转化、重组质粒的筛选和鉴定、测序，其操作过程同实例i之步骤6至10。本实施例以pcambia1304载体为基础，将不包含终止密码子的taasrl的cdna片段插入到35s启动子的下游，gfp基因的上游，使taasrl与gfp形成融合蛋白，由35s启动子启动表达(见图3)。电泳检测、酶切、连接等反应以及测序分析表明，我们已成功构建了pcambia1304-taasrl植物表达载体，为随后的转基因研究奠定了基础。实施例4转taasrl基因烟草株系的获得具体步骤: 1.lba4404农杆菌感受态细胞的制备:(i)挑农杆菌lba4404单菌落接种于5ml含50mg/l str的yeb液体培养基中，28°c暗培养200rpm摇菌过夜；(2)取2ml菌液接种于50ml含50mg/l str的yeb液体培养基中继续震荡培养，至0d600值为0.4左右；(3)将培养好的菌液置于冰上冰浴30min，在4°c下5000rpm离心5min，到掉上层
培养基；(4)向收集的菌体沉淀中加入ioml预冷的20mm cac12，充分重悬菌体；(5) 4°c下5000rpm离心5min,倒掉上清,尽量将液体去除干净；(6)将iml预冷的20mm cacl2重悬菌体，以每100 u i分装一管，迅速置于液氮中冷冻后_70°c保存。2.pcambia1304-taasrl/pcambia1304 表达载体转化农杆菌:(i)取一管制备好的农杆菌感受态细胞，置于冰上融化；(2)加入待转化质粒i ul，轻轻混匀，冰浴30min ；(3)在液氮中冷冻lmin，然后迅速置于37°c水浴锅中水浴5min ；(4)取500iil不含抗生素的yeb液体培养基加入到离心管中，在28°c，200rpm条件下暗培养3-5h ；(5)8000rpm离心lmin,取出部分上层培养基，留下50-100 ii i上清重新悬浮菌体；(6)将菌液涂布在含50mg/l kan, 50mg/l str的yeb固体培养基上，28°c倒置暗培养2-3d，将有单菌落长出。3.阳性克隆的鉴定:通过抽提转化菌落的质粒，pcr扩增目的基因鉴定阳性克隆。引物同实例3之步骤1，扩增程序和反应体系同实例i之步骤11。4.烟草的遗传转化及再生:通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草(horsch etal.1985)。5.阳性植株的pcr检测:提取转化植株的dna利用目的基因及gfp基因序列设计引物进行pcr扩增筛选阳性植株。p6 (taasrl) up:gcaccaccaccacctgttccacp6 (taasrl) down:gctccgggtccttcttcgcctcp7(gfp) up: tggagagggtgaaggtgap7(gfp) down: ctggtaaaaggacagggc本实施例采用根癌农杆菌介导的遗传转化法将pcambia1304-taasrl表达载体转化至烟草中，经潮霉素培养筛选得到to代抗性烟草植株，经pcr检测目的基因和gfp基因从而确认阳性植株。收获to代抗性烟草植株的种子，栽培获得tl代。筛选tl阳性植株并收获种子，栽培获得t2代。继续对t2代植株检测，确定目的基因未发生遗传分离丢失，最终获得含有taasrl稳定遗传的阳性纯合转基因烟草。实施例5转taasrl基因烟草株系的抗旱表型分析及相关生理指标测定1.转taasrl基因烟草株系抗干旱表型分析:分别在ms培养基上萌发野生型、转空载体(pcambia1304)和转目的基因(pcambia1304_taasrl)烟草种子，萌发一周后移栽至沙土培养基质中。在正常光照和给水量条件下，培养二周或者五周。分别对三周和六周的烟草幼苗停止水分供给20或30天，观察转基因植株和野生型的表型。随后，再对其进行供水一周左右，再观察其表型。结果表明，干旱处理20天后，六周的转基因植株叶片卷曲程度明显低于对照植株(见图4a)。而且，干旱处理30天后，三周的转基因植株存活率显著高于对照植株(见图4b和4c)。另外，干旱胁迫后进行复水处理7天，转基因植株的存活率仍然高于对照植株(见图4b)。这些结果表明，转基因植株比对照植株更具有抗干旱胁迫的能力。2.转taasrl基因烟草株系的抗渗透胁迫分析:a.发芽率分析:对野生型、转空载体和转目的基因烟草种子进行表面消毒，然后将其播在ms和含有150或300mm甘露醇的ms培养基上统计不同株系在不同时间的发芽率。结果表明，转基因植株在不同浓度甘露醇渗透培养基上的发芽率明显比对照高(见图5)。b.根长分析:对野生型、转空载体和转目的基因烟草种子进行表面消毒，然后将其播在ms培养基上，一周后将其转移在ms或含有150mm及300mm的ms培养基上。一周后，精确测量各株系的根长。结果表明，转基因植株在不同浓度甘露醇渗透培养基上的根长明显比对照长(见图5)。这些结果证明了，在不同程度的渗透胁迫下，转基因植株在种子萌发及根的延伸过程中表现 出比对照植株更好的生长状态。综合以上表型分析，转基因植株明显比对照植株更具有抵抗干旱和渗透胁迫的能力，说明该基因在作物的抗性改良方面具有一定的应用价值。
权利要求
1.一种分离的小麦aba-胁迫-成熟响应蛋白，其氨基酸序列为: (1)由seqid n0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或 (2)与序列seqid n0.2限定的氨基酸序列同源性在80-100%编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或 (3)seq id n0.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的由(i)衍生的蛋白。
2.编码权利要求1所述蛋白的小麦抗旱基因(taasrl)。
3.权利要求2所述基因，其核苷酸序列如seqid n0.1所示。
4.一种重组表达载体，由含有权利要求2或3所述基因的植物表达载体构成。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的植物表达载体是pcambia1304 载体。
6.含有权利要求4或5所述的重组表达载体的农杆菌lba4404。
7.下述各项之一在培育高抗旱性植物中的应用: (1)权利要求2或3所述的基因； (2)权利要求4或5所述的重组表达载体； (3)含有权利要求4或5所述的重组表达载体的农杆菌lba4404。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的植物为烟草。
9.一种培育具有高抗旱性的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的基因转入植物中。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的基因是通过重组表达载体导入植物中，所述重组表达载体由含有权利要求2或3所述基因的植物表达载体构成。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的植物表达载体是pcambia1304载体。
12.根据权利要求9、10或11所述的方法，其特征在于，所述的植物为烟草。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，是通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种小麦抗旱基因taasr1，其核苷酸序列如seq id no1所示。本发明构建了taasr1基因植物表达载体，用根癌农杆菌介导的方法转化烟草，获得转taasr1基因烟草植株。采用干旱模拟实验证实转taasr1基因烟草比对照烟草具有更强的耐旱能力。
文档编号a01h5/00gk103232533sq20121045380
公开日2013年8月7日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者何光源, 胡伟, 黄超, 杨广笑, 马占兵, 袁倩倩, 王琰, 蔡瑞 申请人:华中科技大学