本发明涉及生物
技术领域：
，尤其是涉及一种硫酸软骨素的加工方法。技术背景硫酸软骨素（chondroitinsulfate）是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，它存在于从线虫到人除植物外的所有生物中，发挥着许多重要的生理功能。虽然多糖的主链结构并不复杂，但就硫酸化程度、硫酸基和两种差异向异构糖醛酸再链内的分布来说，呈现高度的不均一性。硫酸软骨素的精细结构决定着功能的特异性和与多种蛋白质分子的相互作用。它是一种白色或微黄色粉末，吸水性强，易溶于水而成粘稠液体，不溶于酒精、丙酮、乙醚和氯仿等有机溶剂。硫酸软骨素具有调节机体免疫、抗关节炎、抗凝血、调脂降脂、抗动脉粥样硬化以及神经元保护和修复等医药和保健作用。在医学上主要的应用途径是作为治疗关节疾病的药品，与氨基葡萄糖配合使用，具有止痛，促进软骨再生的功效，可以从根本改善关节问题。作为成品的硫酸软骨素应尽可能的去除杂质。关于生产硫酸软骨素产品的加工方法有很多，现有技术如授权公众号为cn103641935b的中国发明专利，公开了一种硫酸软骨素的提取方法，该方法具有工艺简单、周期简短等优点，但其酶解不够彻底、提纯方法粗糙，因此最后的成品纯度不高。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种硫酸软骨素产品的加工方法，该方法具有成品纯度高、操作简单易行，并且可以用于工业生产等优点。本发明针对
背景技术：
：中提到的问题，采取的技术方案为：一种硫酸软骨素产品的加工方法，包括：准备、酶解、透析、碱性含醇水解提纯、醇沉和成品，具体包括以下步骤：准备：称取一定量的猪鼻骨，蒸馏水清洗干净后用温水泡软，然后剪切成2-3cm的块状，加入2-2.5倍量的水，90-100℃蒸煮2-2.5小时，75-85℃保温4-6小时，自然冷却后将上层油脂捞出，溶液留用；酶解：将上述准备步骤后得到的溶液加等量水稀释，用1mol/l氢氧化钠溶液调节ph为8-9，升温至45-55℃，加入10-20mg/g硫酸软骨素提取专用酶，加入酶活性肽5-8mg/g，酶解时间1.5-2小时，升温使酶失活；降温至50-60℃，加入50-60mg/g碱性蛋白酶，加入酶活性肽5-8mg/g，酶解时间1-1.5h，升温使酶失活，过滤得滤液，酶活性肽能提高硫酸软骨素提取专用酶和碱性蛋白酶的水解活性，降低水解时间，水解酶的先后顺序不同有利于蛋白质的彻底水解，有益于后续提纯操作，酶活性肽的氨基酸序列为：scasrcksrcrarrrrcgcrarrcgyyvsvfrc；透析：使用一种孔尺寸为100-150nm的超滤膜对硫酸软骨素溶液进行透析提纯，提纯次数为3-4次，超滤膜对硫酸软骨素有超强隔绝作用，但却能让寡肽、氨基酸与小分子通过，因此能有效提纯溶液中的硫酸软骨素，提高硫酸软骨素的含量；碱性含醇水解提纯：将上述透析所得滤液降温到4-6℃，搅拌下向溶液中缓缓加入两倍滤液体积的氢氧化钠含醇水溶液，该氢氧化钠含醇水溶液含有等体积的0.1-0.2mol/l的氢氧化钠溶液与乙醇，水解3-4小时后离心，取沉淀溶于水中，并以1mol/l盐酸溶液中和，水解液待用，本步骤进一步提纯硫酸软骨素；醇沉：将上述碱性含醇水解提纯后得到的提纯溶液调节ph为6-7，加其重量3%-5%的氯化钠，过滤，再加入乙醇使乙醇质量浓度达到60%-75%，沉淀16小时以上，经典醇沉方案中加入氯化钠有助于提纯；成品：去除上述醇沉液的上层酒精，收集沉淀，脱水干燥，得硫酸软骨素成品，成品为固体有利于保存运输。与现有技术相比，本发明的优点在于：酶活性肽能提高硫酸软骨素提取专用酶和碱性蛋白酶的活性，提高水解速率，缩短反应时间，应用硫酸软骨素提取专用酶和碱性蛋白酶能将蛋白质彻底水解，杂质残留量少，超滤膜和乙醇可以回收循环利用，节约了成本，经过三重提纯工艺后所得到的成品纯度高，操作简单易行可用于工农业生产。具体实施方式下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：一种硫酸软骨素产品的加工方法，包括：准备、酶解、透析、碱性含醇水解提纯、醇沉和成品，具体包括以下步骤：1）准备：称取一定量的猪鼻骨，蒸馏水清洗干净后用温水泡软，然后剪切成2.5cm的块状，加入2倍量的水，95℃蒸煮2小时，75℃保温4小时，自然冷却后将上层油脂捞出，溶液留用；2）酶解：将步骤1得到的溶液加等量水稀释，用1mol/l氢氧化钠溶液调节ph为8，升温至45℃，加入15mg/g硫酸软骨素提取专用酶，酶活性肽5mg/g，酶解时间2小时，升温使酶失活；降温至50℃，加入50mg/g碱性蛋白酶，酶活性肽5mg/g，酶解时间1h，升温使酶失活，过滤，得滤液；3）透析：使用一种孔尺寸为150nm的超滤膜对步骤2所得溶液进行透析提纯，提纯次数为3次；4）碱性含醇水解提纯：将步骤3所得滤液降温到4℃，搅拌下向溶液中缓缓加入两倍滤液体积的氢氧化钠含醇水溶液，该氢氧化钠含醇水溶液含有等体积的0.1mol/l的氢氧化钠溶液与乙醇，水解4小时后离心，取沉淀溶于水中，并以1mol/l盐酸溶液中和，水解液待用；5）醇沉：将步骤4所得到的提纯溶液调节ph为7，加其重量4%的氯化钠，过滤，再加入乙醇使乙醇质量浓度达到70%，沉淀16小时以上；6）成品：去除步骤5后醇沉液的上层酒精，收集沉淀，脱水干燥，得硫酸软骨素成品。实施例2：一种硫酸软骨素产品的加工方法，包括：准备、酶解、透析、碱性含醇水解提纯、醇沉和成品，具体包括以下步骤：1）准备：称取一定量的猪鼻骨，蒸馏水清洗干净后用温水泡软，然后剪切成3cm的块状，加入2.5倍量的水，95℃蒸煮2小时，75℃保温6小时，自然冷却后将上层油脂捞出，溶液留用；2）酶解：将步骤1得到的溶液加等量水稀释，用1mol/l氢氧化钠溶液调节ph为8.5，升温至55℃，加入20mg/g硫酸软骨素提取专用酶，酶活性肽8mg/g，酶解时间1.5小时，升温使酶失活；降温至55℃，加入60mg/g碱性蛋白酶，酶活性肽8mg/g，酶解时间1.5小时，升温使酶失活，过滤，得滤液；3）透析：使用一种孔尺寸为120nm的超滤膜对步骤2所得溶液进行透析提纯，提纯次数为4次；4）碱性含醇水解提纯：将步骤3所得滤液降温到6℃，搅拌下向溶液中缓缓加入两倍滤液体积的氢氧化钠含醇水溶液，该氢氧化钠含醇水溶液含有等体积的0.15mol/l的氢氧化钠溶液与乙醇，水解3小时后离心，取沉淀溶于水中，并以1mol/l盐酸溶液中和，水解液待用；5）醇沉：将步骤4所得到的提纯溶液调节ph为6，加其重量3%的氯化钠，过滤，再加入乙醇使乙醇质量浓度达到60%，沉淀16小时以上；6）成品：去除步骤5后醇沉液的上层酒精，收集沉淀，脱水干燥，得硫酸软骨素成品。实施例3：一种硫酸软骨素产品的加工方法，包括：准备、酶解、透析、碱性含醇水解提纯、醇沉和成品，具体包括以下步骤：1）准备：称取一定量的猪鼻骨，蒸馏水清洗干净后用温水泡软，然后剪切成2cm左右的块状，加入2倍量的水，100℃蒸煮2小时，80℃保温4小时，自然冷却后将上层油脂捞出，溶液留用；2）酶解：将步骤1得到的溶液加等量水稀释，用1mol/l氢氧化钠溶液调节ph为9，升温至55℃，加入15mg/g硫酸软骨素提取专用酶，酶活性肽6mg/g，酶解时间2小时，升温使酶失活；降温至60℃，加入50mg/g碱性蛋白酶，酶活性肽6mg/g，酶解时间1小时，升温使酶失活，过滤，得滤液；3）透析：使用一种孔尺寸为100nm的超滤膜对步骤2所得溶液进行透析提纯，提纯次数为4次；4）碱性含醇水解提纯：将步骤3所得滤液降温到6℃，搅拌下向溶液中缓缓加入两倍滤液体积的氢氧化钠含醇水溶液，该氢氧化钠含醇水溶液含有等体积的0.2mol/l的氢氧化钠溶液与乙醇，水解3小时后离心，取沉淀溶于水中，并以1mol/l盐酸溶液中和，水解液待用；5）醇沉：将步骤4所得到的提纯溶液调节ph为7，加其重量5%的氯化钠，过滤，再加入乙醇使乙醇质量浓度达到75%，沉淀16小时以上；6）成品：去除步骤5后醇沉液的上层酒精，收集沉淀，脱水干燥，得硫酸软骨素成品。将实施例1-3制备的硫酸软骨素，与以现有技术制作方法制得的硫酸软骨素作为对照组，检测各组收率与纯度，数据如下：表1.本发明方法与现有技术制备的硫酸软骨素收率与纯度测试结果例别实施例1实施例2实施例3对照原料猪鼻骨猪鼻骨猪鼻骨猪鼻骨硫酸软骨素收率15.0.8.6.5%硫酸软骨素纯度94.5�.6�.5�.5%通过表1可以看出，本发明方法所制备的硫酸软骨素在收率与纯度方面均远远高于现有技术，而且加入的酶活性肽大大提高了酶解速率，缩短了酶解时间，简化了加工工艺，经过三重提纯使得成品的纯度很高，杂质残留量少，因此可用于工农业生产。本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>慈溪创璞食品技术有限公司<120>一种硫酸软骨素产品的加工方法<130>3<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>33<212>prt<213>人工合成<400>1sercysalaserargcyslysserargcysargalaargargargarg151015cysglycysargalaargargcysglytyrtyrvalservalphearg202530cys当前第1页12