合欢皮皂苷佐剂及其制备方法和含该佐剂的疫苗制剂及用途
【专利摘要】本发明涉及具有免疫佐剂作用的合欢皮皂苷及其制备方法和含该皂苷佐剂的疫苗制剂，以及它们在制备疫苗制剂中的应用。该皂苷是从中药合欢皮中提取分离的合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b，可诱导局部组织产生细胞因子和趋化因子，募集免疫细胞到注射部位，诱生机体同时产生th1型和th2型免疫应答，显示出比现有技术中已知的铝胶佐剂能诱导机体对疫苗产生更强的细胞免疫和体液免疫反应，可以作为多种疫苗的免疫佐剂，发挥理想的免疫效果。以该类皂苷为佐剂的疫苗制备工艺简单、方法简便、质量容易控制、使用方便、可冰冻保存。
【专利说明】合欢皮皂苷佐剂及其制备方法和含该佐剂的疫苗制剂及用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及从中药合欢皮中提取分离的具有免疫佐剂作用的合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b，及其制备方法和含该皂苷佐剂的疫苗制剂，以及它们在制备疫苗制剂中的应用。
【背景技术】
[0002]疫苗接种是预防和控制传染性疾病最经济、有效的手段。dna疫苗、重组疫苗和合成肽疫苗等新型疫苗是近年来发展迅速的一类生物制剂，比常规疫苗具有抗原纯度高、特异性强、安全性好等优势。然而，这些新型疫苗免疫原性弱，免疫效力低下[oyston p,robinso k.the current challenges for vaccine development.j med microbiol2012; 61(7): 889-894]。同此，当前疫苗研究正面临一些复杂病原如疟疾、结核、人免疫缺陷病毒等的重要挑战[leroux-roels g.unmet needs in modern vaccinology:adjuvants to improve the immune response.vaccine 2010; 28 (supp.3): c25-36]。佐剂是传统疫苗和当前新型疫苗必不可少的组成成分，不仅能影响机体对疫苗免疫应答的强度，而且能针对特定病原体诱导最有效的免疫应答类型[mbow ml, de gregorioej valiante nmj et al.new adjuvants for human vaccines.current opinion inimmunology 2010; 22(3): 411-416]。目前研究的免疫佐剂种类很多，如油佐剂、弗氏佐剂、微生物及其代谢产物、核酸及其类似物、细胞因子、脂质体等[dey akj srivastava ik.novel adjuvants and delivery systems for enhancing immune responses inducedby immunogens.expert rev vaccines 2011; 10: 227-51]，但由于存在不同程度的毒副作用或安全隐患等一些不可避免的缺陷而难以实际应用[mbow ml, de gregorio ejvaliante nmj rappuoli r.new adjuvants for human vaccines.curr opin immunol2010，22(3): 411-6; batista-duharte a，lindblad ebj oviedo-orta e.progressin understanding adjuvant immunotoxicity mechanisms.toxicol lett 2011;203(2): 97-105] o铝胶佐剂自192`0s使用以来，直至最近由铝盐和tlr4激动剂3_0_去酰基_4’ -单磷酰脂质a组成的as04被批准之前一直是唯一通过fda批准的人用疫苗佐剂[marrack p， mckee as， munks mw.towards an understanding of the adjuvantaction of aluminium.nat rev immunol 2009; 9: 287-293]。然而，银胶佐剂存在一些问题:①主要通过诱导th2型免疫应答产生抗体起保护作用，不能诱生thl型免疫应答和细胞介导的免疫反应，只适用于以抗体为主要保护性免疫的疫苗(exley c，siesjop，eriksson h.the immunobiology of aluminium adjuvants: how do they reallywork? trends immunol 2010; 31: 103-109) 对人免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒以及血吸虫病、百日咳和伤寒等多种抗原无佐剂作用[o’ hagandtj de gregorio e.the path to a successful vaccine adjuvant - ^the long andwinding road’.drug discov today 2009; 14: 541 - 551] 可促进 ige 抗体产生，容易诱导机体产生过敏反应有局部反应，会形成肉芽肿，极个别可发生局部无菌性脓肿；⑤因其理化性质特点，含铝胶疫苗怕冻，冻后铝胶容易变性；⑥对人、畜神经系统可能有影响。因此，铝胶佐剂已远远不能满足新型疫苗发展的要求[kool m, fierens k，lambrecht bn.alum adjuvant: some of the tricks of the oldest adjuvant.j medmicrobiol 012; 61 (7): 927-934]。寻找安全、有效、新型的免疫佐剂是当前疫苗研究领域的一个热点[schijns vejcj lavelle ec.trends in vaccine adjuvants.expertrev vaccines 2011; 10(4): 539-550]。免疫佐剂研究现已被列为疫苗研究的优先领域[harandi am， medaglini d, shattock rj.vaccine adjuvants: a priority forvaccine research.vaccine 2010; 28(12): 2363-2366; harand am， brewe j， schijnv.conference scene: recent advancements in immunopotentiators for modernvaccines.1mmunotherapy 2011; 3(11): 1297-301]。
[0003]天然药物用于防治疾病具有悠久的历史。当今，fda批准的药物约30%来源于天然药物。新的具有免疫活性的天然产物的发现日益成为研究重点，尤其在寻找新一代疫苗佐剂方面[licciardi pvj underwood jr.plant-derived medicines: a novel classof immunological adjuvants.1nt immunopharmacoi 2011; 11 (3): 390-398]。阜苷(saponin)是一类广泛存在于中药和天然药物中的重要免疫活性物质[rios jl.effectsof triterpenes on the immune system.j ethnopharmacol 2010; 128: 1-14]。自1951年发现皂苷能增强机体对口蹄疫疫苗的免疫应答以来，其佐剂作用受到了广泛的关注。研究最多的是南美阜树(quillaja saponaria molina )树皮中筛选到具有佐剂活性
总阜苷-quil a 及其活性成分 qs-21 [skene cd and sutton p.saponin-adjuvanted
particulate vaccines for clinical use.methods 2006; 40: 53-9]0 quil a和 qs-21对外源性抗原既能剌激thl免疫应答，又能诱导细胞毒性t淋巴细胞(ctl)应答。这一独特的特性使其成为亚单位疫苗、细胞内病原体疫苗及癌症疫苗的理想佐剂[mbawuikei， zang y， couch rb.humoral and cell-mediated immune responses of humans toinactivated influenza `vaccine with or without qs21 adjuvant.vaccine 2007;25(17): 3263-9]。但quil a存在严重的缺陷:①溶血性强、毒副作用大，可引起局部组织坏死，甚至全身不良反应和中毒[waite dc, jacobson ewj ennis fa, edelman r，whiteb, kammer r， et al.three double-blind, randomized trials evaluating the safetyand tolerance of different formulations of the saponin adjuvant qs-21.vaccine2001; 19: 3957-7.]。临床安全性评价结果表明:quil a用于人不安全。目前除了用于为某些绝症设计的疫苗如癌症疫苗和人免疫缺陷病重组疫苗等人用疫苗外，主要限用于口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗等兽用疫苗。②其主要活性成分如qs-21、qs-17、qs-18和qs-7等分子结构中均存在酰基，易水解，其去酰化水解产物失去诱导thl型免疫应答及产生特异性ctl 的能力，只能引发 th2 型免疫应答[kensil cr.1mmunomodulatory adjuvants fromquillaja saponaria.1mmunopotentiators in modern vaccines 2007; 109-22.] ；(3)南美皂树资源匮乏，总皂苷含量低，同时quil a中单体化合物分子量大，化学结构十分复杂，分离制备困难。因此，从天然药物中寻找筛选高效、低毒的皂苷佐剂受到国内外学者高度的关注[sun hx, xie y，ye yp.advances in saponin-based adjuvants.vaccine 2009,27(12): 1787-1796]。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一类用于疫苗的具有显著免疫佐剂作用的合欢皮皂苷佐剂。
[0005]本发明的另一个目的是提供从中药合欢皮中提取分离合欢皮皂苷佐剂的方法。
[0006]本发明的进一步目的是提供一种包含所述合欢皮皂苷佐剂的疫苗制剂。
[0007]本发明的还有一个目的是提供所述合欢皮皂苷佐剂在制备疫苗制剂中的应用。
[0008]本发明的合欢皮皂苷佐剂包括从中药合欢皮中提取分离的合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b。
[0009]本发明提供的合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b是从中药合欢皮中提取分离的，制备方法包括以下步骤，
以下所说浓度均为质量浓度:
a.将合欢皮药材粉碎后，以乙醇提取；
b.浓缩乙醇提取液，以水混悬，用乙醚或醋酸乙酯萃取至有机溶剂层近无色，得到水层溶液；
c.取水层以水饱和的正丁醇或戊醇萃取，合并萃取液，减压回收、浓缩，得到醇萃取
物；
d.取步骤b中的水层溶液或步骤c中的醇萃取物在大孔吸附树脂柱中进行色谱纯化，以水和浓度75%乙醇依次洗脱，收集浓度75%乙醇洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得合欢皮粗皂苷;`
e.合欢皮粗皂苷经大孔吸附树脂柱分离，以浓度30%、50%、75%乙醇依次洗脱，分别收集浓度50%乙醇和浓度75%乙醇的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到2个流份；
f.取步骤d中合欢皮粗皂苷和步骤e中2个流份再分别经离子交换树脂色谱柱精制，以浓度70%乙醇进行洗脱，收集浓度70%乙醇吸收液，浓缩，冷冻干燥，得到合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)。
[0010]上述步骤d和步骤e的中所说的大孔吸附树脂为dlol大孔吸附树脂；步骤f中所说的离子交换树脂为d941弱碱性阴离子交换树脂。
[0011]本发明的含合欢皮皂苷佐剂的疫苗制剂，包含有免疫有效量的合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a或合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b以及含有一种或多种药物学上可接受的载体。
[0012]本发明的合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a或合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b可在制备疫苗制剂中应用。
[0013]上文所述药学上可接受的载体是指药学领域的药物载体。例如:稀释剂、赋形剂如水、生理盐水、葡萄糖、甘露醇、甘油、乙醇及其混合物等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、海藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如吐温-80 ;润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅料如香味剂、甜味剂等。
[0014]本发明的疫苗制剂可以是溶液、混悬液或乳浊液形式，可通过口服、鼻吸入、直肠、肠胃外或经皮给药的方式施用于需要接种的对象。本发明的疫苗制剂用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、缓释微丸、固体分散体、包含物等，制成的液体制剂如混悬剂、乳剂、溶胶剂、糖浆剂、合剂、溶液剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性混悬剂、乳剂、冻干粉、脂质体、微囊、微球、纳米囊、纳米球等。优先的形式是注射用冻干粉及溶液。
[0015]本发明的疫苗制剂可按照药学和疫苗领域的任何常规生产方法制备。
[0016]疫苗制剂的典型单剂量可以根据制剂的形式而变化，并根据抗原种类、所需的抗体水平、接种对象的特异性及所需的免疫程序等各种因素进行确定。本发明的疫苗制剂中合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a或者合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b的量可为0.0 iiig~i g /单剂量，优选为0.1~iooiig/单剂量。可以一次或多次施用。 [0017]本发明的优点
本发明具有免疫佐剂作用的皂苷(包括合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b)可诱导局部组织产生细胞因子和趋化因子，募集免疫细胞到注射部位，诱生机体同时产生thl型和th2型免疫应答，且显示出比现有技术中已知的铝胶佐剂能诱导机体对疫苗产生更强的细胞免疫和体液免疫反应。因此，可以作为多种疫苗的免疫佐剂，发挥理想的免疫效果。以该类皂苷为佐剂的疫苗制备工艺简单、方法简便、质量容易控制、使用方便、可冰冻保存。该类皂苷成分的溶血性小和安全性好。所以，本发明的皂苷有望开发成疫苗佐剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)对ova受免小鼠血清中特异性igg抗体效价的影响。ova:卵清蛋白；alum:铝胶,/x0.05、bzx0.01 和 c/x0.001 ks ova 对照组；d/x0.05、^<0.01 和f/x0.001 ks铝胶对照组。
[0019]图2为合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)对ova受免免疫小鼠血清中特异性iggl抗体效价的影响。ova:卵清蛋白；alum:铝胶,/x0.05、屮〈0.01 和 c/k0.001 ks ova 对照组；d/x0.05,^0.01和f/x0.001 ks铝胶对照组。
[0020]图3为合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b(ajsb)对ova受免小鼠血清中特异性igg2a抗体效价的影响。ova:卵清蛋白；alum:铝胶,/x0.05、bzx0.01 和 c/x0.001 ks ova 对照组；d/x0.05、^<0.01 和f/x0.001 ks铝胶对照组。
[0021]图4为合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b(ajsb)对ova受免小鼠血清中特异性igg2b抗体效价的影响。ova:卵清蛋白；alum:铝胶,/x0.05、bzx0.01 和 c/x0.001 ks ova 对照组；d/x0.05、^<0.01 和f/x0.001 ks铝胶对照组。
[0022]图5为合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)对con a刺激的ova受免小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。ova:卵清蛋白；alum:铝胶；a/x0.05、b/x0.01 和 cp
[0023]图6为合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a(ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b(ajsb)对lps刺激的ova受免小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。ova:卵清蛋白；alum:铝胶 ^/x0.05、b/x0.01 和。/x0.001 ks ova对照组；d/x0.05 和 ezx0.01 ks
铝胶对照组。
[0024]图7为合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)对ova刺激的ova受免小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。ova:卵清蛋白；alum:铝胶；b/x0.01和。/x0.001 ks ova对照组；少〈0.05 ks铝胶对照组。
[0025]图8为合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)对ova受免小鼠自然杀伤(nk)细胞活性的影响。ova:卵清蛋白；alum:铝胶^/x0.05和bzx0.01 ks ova对照组；少〈0.05 ks铝胶对照组。
[0026]图9为合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a(ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)对禽流感鸡痘病毒载体活疫苗(rfpv)免疫小鼠血清中特异性igg 抗体效价的影响。alum:铝胶；^<0.01 和 czx0.001 ks ova 对照组;屮〈0.05，ezx0.01和f/x0.001 ks铝胶对照组。
[0027]图10为合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)对禽流感鸡痘病毒载体活疫苗(rfpv)免疫小鼠血清中特异性iggl抗体效价的影响。alum:铝胶；^<0.001 ks ova对照组；^<0.05、e/x0.01和f/x0.001 ks铝胶对照组。
[0028]图11为合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)对禽流感鸡痘病毒载体活疫苗(rfpv)免疫小鼠血清中特异性igg2a抗体效价的影响。alum:铝胶;bp<0.01和c/x0.001 ks ova对照组；^<0.01和f/x0.001 ks铝胶对照组。
[0029]图12为合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)对禽流感鸡痘病毒载体活疫苗(rfpv)免疫小鼠血清中特异性 igg2b 抗体效价的影响。alum:铝胶；cp<0.001 ks ova 对照组；e/x0.01 和 f/x0.001 ks铝胶对照组。 [0030]图13为合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)对ova免疫小鼠迟发性超敏(dth)反应的影响。ova:卵清蛋白；alum:铝胶。bzx0.01 和 e/x0.001 ks ova 对照组。
[0031]图14为合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)肌内注射对小鼠局部组织细胞因子蛋白表达的影响。
[0032]图15为合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)肌内注射对小鼠局部组织趋化因子蛋白表达的影响。
[0033]图16为合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)肌内注射对局部组织免疫细胞募集的影响。dcs:树突状细胞；neutrophils:中性粒细胞；eosinophils:嗜酸性粒细胞；mastcells:肥大细胞。
【具体实施方式】
[0034]以下通过实例进一步说明本发明，而非限制其范围。
[0035]以下所说浓度均为质量浓度。[0036]实施例1:合欢皮皂苷制备 制备合欢皮总皂苷
药材桔梗粗粉i kg，以浓度70%乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浸膏加适量水混悬，用乙醚萃取至醚液近无色。水层以水饱和正丁醇萃取，直至萃取液近无色，合并萃取液，减压回收、浓缩，得到醇萃取物。醇萃取物经dlol大孔吸附树脂柱，依次用水和浓度75%乙醇进行洗脱，用薄层色谱检查洗脱液，具有相同斑点的流份合并，减压回收、浓缩，冷冻干燥，得合欢皮粗皂苷。粗皂苷混悬于蒸馏水中，上d941弱碱性阴离子交换树脂色谱柱纯化，浓度70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压回收、浓缩，冷冻干燥，得合欢皮总皂苷(ajs)。
[0037]药材桔梗粗粉i kg，以70%乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浸膏加适量水混悬，用乙醚萃取至醚液近无色。水层以醋酸乙酯萃取，直至萃取液近无色，水层减压回收、浓缩，经dlol大孔吸附树脂色谱柱，依次用水和浓度75%乙醇进行洗脱，用薄层色谱检查洗脱液，具有相同斑点的流份合并，减压回收、浓缩，冷冻干燥，得合欢皮粗皂苷。粗皂苷混悬于蒸馏水中，上d941弱碱性阴离子交换树脂色谱柱纯化，浓度70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压回收、浓缩，冷冻干燥，得合欢皮总皂苷(ajs)。
[0038]合欢皮总阜苷为浅黄白色粉末。lieberman-burchard反应和molish反应均呈阳性，示含三萜皂苷化合物。以齐墩果酸为对照标准品，香草醛浓硫酸显色，紫外分光光度仪于540 nm比色测得ajs中总皂苷含量为37.65%。
[0039]制备合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a
药材桔梗粗粉i kg，以70%乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浸膏加适量水混悬，用乙醚萃取至醚液近无色。水层以醋酸乙酯萃取，直至萃取液近无色，水层减压回收、浓缩，经dlol大孔吸附树脂色谱柱，依次用水和浓度75%乙醇洗脱，用薄层色谱检查洗脱液，具有相同斑点的流份合并，减压回收、浓缩，冷冻干燥，得合欢皮粗皂苷。合欢皮粗皂苷进行大孔吸附树脂柱色谱，以水、浓度30%乙醇和浓度50%乙醇依次洗脱，收集浓度50%乙醇洗脱液，减压回收、`浓缩，浓缩液上d941弱碱性阴离子交换树脂色谱柱纯化，以浓度70%乙醇进行梯度洗脱，用薄层色谱检查洗脱液，具有相同斑点的流份合并，减压回收、浓缩，冷冻干燥，得合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)0合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a为近白色粉末。lieberman-burchard反应和molish反应均呈阳性,示含三職阜苷化合物。以齐墩果酸为对照标准品，香草醛浓硫酸显色，紫外分光光度仪于540 nm比色测得ajs中总皂苷含量为46.72%。
[0040]制备合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b
药材桔梗粗粉i kg，以浓度70%乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浸膏加适量水混悬，用乙醚萃取至醚液近无色。水层以醋酸乙酯萃取，直至萃取液近无色，水层减压回收、浓缩，经dlol大孔吸附树脂色谱柱，依次用水和浓度75%乙醇进行洗脱，用薄层色谱检查洗脱液，具有相同斑点的流份合并，减压回收、浓缩，冷冻干燥，得合欢皮粗皂苷。合欢皮粗皂苷进行大孔吸附树脂柱色谱，以水、3浓度0%乙醇、浓度50%乙醇和浓度75%依次洗脱，收集浓度75%乙醇洗脱液，减压回收、浓缩，浓缩液上d941弱碱性阴离子交换树脂色谱柱纯化，以浓度70%乙醇进行洗脱，用薄层色谱检查洗脱液，具有相同斑点的流份合并，减压回收、浓缩，冷冻干燥，得合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b(ajsb)。合欢皮阜苷佐剂活性有效部位b为浅黄白色粉末。lieberman-burchard反应和molish反应均呈阳性，示含三萜皂苷化合物。以齐墩果酸为对照标准品，香草醛浓硫酸显色，紫外分光光度仪于540 nm比色测得ajs中总皂苷含量为51.99%。
[0041]实施例2含皂苷佐剂的乙肝疫苗制剂
称取合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a或者合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b 500ii g和重组乙型肝炎病毒表面抗原(rhbsag) iooii g，以生理盐水10 ml溶解，以
0.22 ii m微孔滤膜滤过,无菌分装,每支i ml。每ml含阜苷50 y g和rhbsag 10 u go
[0042]实施例3含铝胶和皂苷佐剂的乙肝疫苗制剂
称取合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a或者合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b适量，以生理盐水溶解，制成浓度为100 u g/ml的溶液，以0.22 ii m微孔滤膜滤过。将该皂苷溶液与等体积的含铝佐剂乙型肝炎病毒表面抗原疫苗原液(每ml含hbsag 20 ug和氢氧化招500 ii g),混合均匀,无菌分装,每支lml。每ml含阜苷50 ii g、hbsag 10 ii g和氢氧化招250 u go
[0043]实施例4 合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b的溶血性
以真空采血管从兔耳静脉采 集血液，加生理盐水，混匀，1500 r/m离心10 min，洗涤3次，收集红细胞以生理盐水稀释制成0.5%红细胞悬液，备用。取quil a、合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b，分别用生理盐水溶解，并作倍比稀释制成浓度为1000、500、250、125、62.5,31.25、15.63,7.81 u g/ml的稀释液。于96孔微量板中，分别加入0.5%兔红细胞悬液100 u i及不同浓度的皂苷稀释液100 u 1，混匀，每个浓度重复3孔。另设生理盐水及蒸馏水分别作为最小和最大的溶血性对照。37°c培养箱孵育30 min, 1500 r/m离心lomin。各孔取上清液100 y i,以酶标仪于波长405 nm处测定od值。重复3次，计算引起50%溶血的浓度(hd5tl)。结果显示:合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b对0.5%兔红细胞的hd50值分别为 25.66 ±0.97、195.8 ±6.2 和 7.87 ±0.30 y g/ml，而 quil a 在相同条件下测得的 hd50值为2.10±0.08 u g/ml。说明合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b的溶血性均显著低于quil a 0° < 0.001)。
[0044]实施例5合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b对ova受免小鼠免疫应答反应的佐剂作用
实验方法:清洁级icr小鼠随机分组，每组5只。pbs对照组:每只注射磷酸缓冲液(pbs) 0.2 ml ;卵清白蛋白(ova)对照组:每只注射含ova 100 y g的pbs 0.2 ml ;氢氧化铝对照组:每只注射含200 u g氢氧化铝和100 u g ova的pbs 0.2 ml ;合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b试验组:每只注射含皂苷(50,100,200 u g)和100 u g ova的pbs 0.2 ml。各组皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫间隔14天。二免后14天，采血，分离血清，检测特异性抗体效价；将小鼠断颈处死，无菌条件下取脾，制备脾细胞悬液，进行脾细胞增殖反应和nk细胞活性分析。
[0045]结果表明:合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)能显著促进con a、lps和ova诱导的ova受免小鼠脾细胞增殖反应(图1~3);提高免疫小鼠血清中ova特异性igg, iggu igg2a和igg2b抗体效价(图4~7);增强免疫小鼠nk细胞对k562细胞的杀伤活性(图8)。说明合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)不仅能促进免疫小鼠对ova的体液免疫和细胞免疫应答，而且可诱导平衡的thl/th2免疫应答，对模式抗原ova具有显著的佐剂作用。
[0046]实施例6 合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b对禽流感鸡痘病毒载体活疫苗的佐剂作用
实验方法:将合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)以pbs溶解制成浓度分别为0.5、1.0和2.0 mg/ml的稀释液，以0.22 微孔滤膜滤过，备用。将商品铝胶(alum)以生理盐水稀释制成2 mg/ml的混悬液。将商品禽流感鸡痘病毒载体活疫苗(rfpv)加入pbs 50 ml，混匀，制成疫苗稀释液。取疫苗稀释液与等量的pbs、铝胶稀释液、合欢皮总皂苷(ajs)稀释液、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)稀释液或合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)稀释液混匀，分别于第i和15天皮下注射免疫小鼠。二免后14天，采血，分离血清，进行h5抗原特异性抗体效价检测。
[0047]结果表明:合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)能显著提高禽流感鸡痘病毒载体活疫苗(rfpv)免疫小鼠血清中h5抗原特异性igg、iggu igg2a和igg2b抗体滴度，且免疫小鼠血清中h5抗原特异性igg、iggu igg2a和igg2b抗体滴度显著高于alum免疫组(图9~12)。说明合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)三者都能同时诱导免疫小鼠对禽流感鸡痘病毒载体活疫苗的thl型和th2型免疫应答反应，对禽流感鸡痘病毒载体活疫苗具有显著的佐剂作用，且佐剂活性显著优于铝胶佐剂。
[0048]实施例7合欢皮总`皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b对ova受免小鼠迟发性超敏反应的影响
实验方法:清洁级icr小鼠随机分组，每组5只。pbs对照组:每只注射磷酸缓冲液(pbs) 0.2 ml ;卵清白蛋白(ova)对照组:每只注射含ova 100 y g的pbs 0.2 ml ;氢氧化铝对照组:每只注射含200 u g氢氧化铝和100 u g ova的pbs 0.2 ml ;合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b试验组:每只注射含皂苷(50,100,200 u g)和100 iigova的pbs 0.2 ml。皮下注射致敏5天后小鼠左后足垫皮下注射含ova 100 iig的pbs 0.05 ml进行激发，右后足垫皮下注射pbs 0.05 ml作为对照。24小时后，用游标卡尺测量后足垫厚度(精确到0.01 mm)，以左右后足垫厚度差作为肿胀度，评定迟发性超敏反应强弱。
[0049]结果表明:合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)能显著促进ova受免小鼠对ova诱导的迟发性超敏反应，而铝胶佐剂对ova受免小鼠迟发性超敏反应无显著影响(图13)。说明合欢皮总皂苷(ajs)、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a (ajsa)和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)三者均能显著诱导ova首免小鼠细胞介导的免疫反应，进一步证实三者对ova受免小鼠细胞免疫应答具有显著的佐剂作用，而铝胶佐剂对细胞介导的免疫应答反应没有佐剂作用。
[0050]实施例8合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b肌内注射对小鼠局部组织细胞因子和趋化因子蛋白表达水平的影响
实验方法:清洁级balb/c小鼠随机分组，每组3只。pbs对照组:每只小鼠右肢肱四头肌注射pbs缓冲液0.05 ml ;合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)试验组:每只小鼠右肢肱四头肌注射含合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)iooiig的pbs缓冲液0.05 ml。注射后4小时，断颈处死小鼠，75%酒精消毒后，剪开皮肤，收集肱四头肌，采用小鼠炎症因子抗体芯片检测其中40种细胞因子和趋化因子蛋白表达水平。
[0051]结果表明:合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)注射后可诱导或上调ifn- y、il-1 ^、il-3、il-6、il-9、il-10、il_12p40/p70、il_12p70、il-13、tnf-a、可溶性肿瘤坏死因子i型(stnfri)、iii型(stnfr iii)等12种细胞因子(图14)，以及嗜酸性粒细胞趋化蛋白(eotaxin)、巨噬细胞炎症因子la (mip-1a ), 0 -趋化性细胞因子(rantes)、人胸腺表达趋化因子(teck)、cx3c类趋化因子(fractalkine)、干扰素诱导的t细胞a型趋化因子(1-tac)、血浆炎性趋化因子(mig)、fasl、m-csf和gm-csf等10个趋化因子(图15)蛋白表达。
[0052]实施例9合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b肌内注射对小鼠局部组织免疫细胞募集的影响
实验方法:清洁级balb/c小鼠随机分组，每组4只。pbs水对照组:每只小鼠肱四头肌各注射pbs缓冲液0.05 ml ;卵清白蛋白(ova)对照组:每只小鼠肱四头肌各注射含ova25 ug的pbs 0.05 ml ;合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)试验组:每只小鼠肱四头肌各注射含合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb) 50 ii g的pbs缓冲液0.05 ml ;卵清白蛋白与合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)联合组:每只小鼠肱四头肌各注射含ova 25 u g和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb) 50 iig的pbs缓冲液0.05 ml。注射后24小时，断颈处死 小鼠，75%酒精消毒后，剪开皮肤，收集肱四头肌，以0.05% ii型胶原酶溶液消化制备单细胞悬液，经抗小鼠⑶16/⑶32抗体封闭，以抗小鼠⑶lie -pe、cdllb - fitc、ly-6g - pe_cy5、ly-6c - apc, f4/80 antigen - pe_cy5、fcerl - apc 和、siglec-f - pe等抗体组合染色，流式细胞仪分析树突状细胞(⑶iib ⑶ilc )、中性粒细胞(cdllc ly-6c ly6ghigh)、炎性单核细胞(cdllb ly6g_ly6c )、巨噬细胞(cdllb f4/80high)、嗜酸性粒细胞(cdllb sigilec f )和肥大细胞(fcerl )等6类细胞的数量。
[0053]结果表明:合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b (ajsb)注射后可显著募集树突状细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞进入注射部位(图16)。
[0054]综上所述，本发明的合欢皮皂苷具有显著的免疫佐剂作用，可诱导局部组织产生细胞因子和趋化因子，募集免疫细胞到注射部位，诱生机体同时产生thl型和th2型免疫应答，且显示出比现有技术中已知的铝胶佐剂能诱导机体对疫苗产生更强的细胞免疫和体液免疫反应。同时，以该类皂苷为佐剂的疫苗制备工艺简单、方法简便、质量容易控制、使用方便、可冰冻保存。该类皂苷成分的溶血性小和安全性好。所以，本发明的合欢皮皂苷有望开发成疫苗佐剂。
【权利要求】
1.合欢皮皂苷佐剂，其特征是从中药合欢皮中提取分离的合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b。
2.制备权利要求1中所述的合欢皮皂苷佐剂的方法，该方法包括以下步骤， 以下所说浓度均为质量浓度: a.将合欢皮药材粉碎后，以乙醇提取； b.浓缩乙醇提取液，以水混悬，用乙醚或醋酸乙酯萃取至有机溶剂层近无色，得到水层溶液； c.取水层以水饱和的正丁醇或戊醇萃取，合并萃取液，减压回收、浓缩，得到醇萃取物； d.取步骤b中的水层溶液或步骤c中的醇萃取物在大孔吸附树脂柱中进行色谱纯化，以水和浓度75%乙醇依次洗脱，收集浓度75%乙醇洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得合欢皮粗皂苷; e.合欢皮粗皂苷经大孔吸附树脂柱分离，以浓度30%、50%、75%乙醇依次洗脱，分别收集浓度50%乙醇和浓度75%乙醇的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到2个流份； f.取步骤d中合欢皮粗皂苷和步骤e中2个流份再分别经离子交换树脂色谱柱精制，以浓度70%乙醇进行洗脱，收集浓度70%乙醇吸收液，浓缩，冷冻干燥，得到合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有 效部位a和合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤d和步骤e的中所说的大孔吸附树脂为dlol大孔吸附树脂；步骤f中所说的离子交换树脂为d941弱碱性阴离子交换树脂。
4.含合欢皮皂苷佐剂的疫苗制剂，其特征在于包含有免疫有效量的权利要求1所述的合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a或者合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b和药物学上可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的疫苗制剂，其特征在于合欢皮总皂苷、合欢皮皂苷佐剂活性有效部位a或者合欢皮皂苷佐剂活性有效部位b的量为0.01 μ g~ig /单剂量。
6.根据权利要求1所述的合欢皮皂苷佐剂在制备疫苗制剂中的应用。
【文档编号】a61k36/48gk103768593sq201410005853
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】孙红祥 申请人:浙江大学